利用無(wú)細(xì)胞體系篩選參與亮氨酸調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路的關(guān)鍵候選蛋白質(zhì).pdf

1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1，mammalian target of rapamycincomplex1)的激活不僅能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，還能抑制自噬等蛋白質(zhì)的降解途徑的發(fā)生。氨基酸尤其是亮氨酸不僅是蛋白質(zhì)合成的原料，也能作為信號(hào)分子參與mTORC1的激活過(guò)程。近年來(lái)，越來(lái)越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)參與氨基酸激活mTORC1的過(guò)程。然而，關(guān)于氨基酸在細(xì)胞內(nèi)的感應(yīng)機(jī)制尚不明確，細(xì)胞中還可能存在其它未知的蛋白質(zhì)分子參與氨基酸激活mTOR

2、C1的過(guò)程。
　　本研究通過(guò)構(gòu)建用于研究mTORC1信號(hào)通路的無(wú)細(xì)胞體系(Cell-freesystem)，結(jié)合同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量iTRAQ(isobaric tags for relative andabsolute quantification)技術(shù)及生物信息學(xué)分析，初步篩選參與亮氨酸調(diào)節(jié)mTORC1信號(hào)通路的關(guān)鍵差異候選蛋白質(zhì)。本研究的無(wú)細(xì)胞體系由溶酶體粗提物(包括P20(+)和P20(-))、胞漿蛋白(包括S100(

3、+)和S100（-））、純化的標(biāo)簽蛋白HA-raptor（mTORC1的組分之一）組成。無(wú)細(xì)胞體系結(jié)果表明，在由胞漿蛋白S100(-)和溶酶體粗提物P20(-)組成的無(wú)細(xì)胞體系中，亮氨酸能促進(jìn)Raptor與溶酶體P20(-)的結(jié)合。無(wú)細(xì)胞體系反應(yīng)完成后，我們將對(duì)照組的上清和沉淀(S1，P1)與亮氨酸組的上清和沉淀(S2，P2)進(jìn)行iTRAQ試驗(yàn)。本次iTRAQ試驗(yàn)共鑒定到6292個(gè)蛋白，以變化倍數(shù)(Fold change)＞1.2或＜0

4、.83和Q值(Q-value)＜0.05兩個(gè)條件進(jìn)行差異蛋白的篩選。在P2-VS-P1組中，上調(diào)差異蛋白數(shù)(Up-regulated proteins)為208個(gè)，下調(diào)差異蛋白數(shù)(Down-regulatedproteins)為190個(gè);在S2-VS-S1組中，上調(diào)差異蛋白數(shù)(Up-regulated proteins)為12個(gè)，下調(diào)差異蛋白數(shù)（Down-regulated proteins）為3個(gè)。對(duì)上述差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析（包

5、括GO、COG注釋、Pathway注釋分析）后發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要為細(xì)胞器上參與代謝過(guò)程的蛋白，且參與脂質(zhì)代謝和與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白也可能參與亮氨酸對(duì)mTORC1的激活過(guò)程。
　　參與亮氨酸激活mTORC1信號(hào)通路的關(guān)鍵差異候選蛋白需要綜合考慮上清和沉淀中的差異蛋白。其中，在上清中下調(diào)且在沉淀中上調(diào)的蛋白數(shù)為0，而在上清中上調(diào)且在沉淀中下調(diào)的蛋白有6個(gè)，因而我們初步將這6個(gè)蛋白(APOA1、CFH、FGA、ERH、CANX、F

6、2)定義為參與亮氨酸激活mTORC1信號(hào)通路的關(guān)鍵差異候選蛋白。對(duì)CANX進(jìn)行初步驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，無(wú)細(xì)胞體系樣品中該蛋白的分布規(guī)律與iTRAQ數(shù)據(jù)一致，且CANX與溶酶體上的標(biāo)志性蛋白Lamp2的共定位結(jié)果也說(shuō)明亮氨酸能促進(jìn)CANX向細(xì)胞質(zhì)中遷移。
　　綜上所述，(1)本研究首次成功構(gòu)建了用于研究亮氨酸調(diào)節(jié)mTORC1信號(hào)通路的無(wú)細(xì)胞體系，且該體系有效性好，穩(wěn)定性高。(2) iTRAQ數(shù)據(jù)與生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，APOA1、CFH、