用原子力顯微鏡（AFM）進行蛋白質(zhì)晶體生長及成核研究.pdf

1、生物大分子(包括蛋白質(zhì)、核酸和病毒等)對生物體的生命活動起著十分重要的作用，這是由它們具有特殊的空間結(jié)構(gòu)所致。隨著生物學(xué)領(lǐng)域?qū)_的生物大分子結(jié)構(gòu)需求的日益增加，尤其是利用單晶X射線衍射法得到的三維結(jié)構(gòu)，使得研究生物大分子晶體的生長越來越受到重視。然而，生物大分子的結(jié)晶相當困難，從某種意義上講這是生物大分子結(jié)構(gòu)測定的限速因素。目前對生物大分子的晶體生長機理、成核的過程、基本的熱力學(xué)和動力學(xué)參數(shù)等的認識很少，所以在晶體的缺陷、分子在晶格中

2、的定向力和分子間鍵連作用以及溶液中傳質(zhì)過程方面的認識也很有限。因此，進行的生物大分子晶體生長的研究就顯得非常必要。目前已有一些技術(shù)應(yīng)用于研究生物大分子晶體的生長機理中，如光散射技術(shù)(QELS)和原子力顯微鏡(AFM)等，而迄今為止，AFM仍為進行這一研究的非常重要的工具。 本論文通過AFM實驗主要進行了部分蛋白質(zhì)晶體的生長過程的研究，包括杜仲抗真菌蛋白(Eucommiaantifungalprotein，簡稱EAFP)、天花粉蛋

3、白(Trichosanthin，簡稱TCS)、天麻抗真菌蛋白(Gastrodiaelataantifungalprotein，簡稱GAFP)，并取得了一定進展，有一些新的發(fā)現(xiàn)： 1.EAFP在其水溶液中能形成一種環(huán)狀聚集體，在40mg/ml的高濃度時其直徑大小從100nm到300nm左右，而在低濃度(5mg/m/l)時只有10-25nm左右，且數(shù)量較少。有的形成一個完整的環(huán)，有的環(huán)正在形成。這說明EAFP分子間本身有著較強的相互

4、作用，能自發(fā)地在水溶液中進行聚集，且隨溶液的濃度變小而聚集能力降低。 2.EAFP晶體的生長速度很快，通常只需要數(shù)小時就可長到較大尺寸(約1mm)，要比普通的蛋白質(zhì)晶體生長快很多倍，而且沿著晶體學(xué)軸向的生長速率也各不相同，表現(xiàn)出明顯的各向異性；且生長的速率還與蛋白質(zhì)溶液的過飽和度密切相關(guān)，過飽和度較高時(大于1.78)生長極為快速，難以進行速率的測量；當過飽和度為1.45時，EAFP晶體的{100}面上的生長速率b方向上平均為1

5、2nm/s，c方向上平均為24.2nm/s；當過飽和度為1.15時，其生長速率b方向上為4.1nm/s；c方向上為8.8nm/s，而此時，其生長速率仍與報道的其他蛋白質(zhì)晶體生長速率基本相當，這些都說明EAFP晶體具有很快的生長速率。 3.實時原位AFM研究EAFP單斜晶體{100}面的生長過程結(jié)果表明EAFP晶體生長并非以單一的生長模式進行，而是隨生長條件的變化采取不同的生長特征，有以下因素可能與EAFP的晶體快速生長機制相關(guān)：

6、①多重不對稱二維島堆垛生長源；②活潑的不對稱螺旋錯位生長源(主要以不對稱的雙左旋為主，以不斷出現(xiàn)的多個無規(guī)的右旋為次)；③臺階按編組生長的動態(tài)特性。 4.EAFP在低過飽和度下的螺旋生長過程中會出現(xiàn)臺階的合并，從而表現(xiàn)出單-雙的螺旋臺階，在小范圍掃描中捕獲到了這種現(xiàn)象，使得對螺旋生長臺階的合并過程有了更加深入的認識；并且臺階的生長受到沿晶體學(xué)b軸方向上的21螺旋對稱的控制；當臺階生長至第八到第九層時，螺旋臺階會自動地形成完整的生

7、長層，這充分說明了EAFP分子或分子簇具有良好的自身調(diào)節(jié)能力，這樣在晶體生長過程中，晶體的缺陷減少，晶體質(zhì)量提高，這也可說明EAFP晶體的x射線衍射能力很強的原因。 5.通過對EAFP晶體中各種相互作用分析表明：一個EAFP分子與周圍的相鄰分子間有218個殘基間的相互作用，其中有18個是強的相互作用，有72個較強作用(間距小于4埃)，這些作用大部分與晶體學(xué)c方向上的作用相關(guān)，說明在c方向上作用較強。由于這種差別，使得EAFP在結(jié)

8、晶過程中，當分子受到不同方向上的作用力時，便形成了表面形貌的不對稱，進而影響到晶體的外貌。另外，通過大分子結(jié)構(gòu)分析XPLOR(NIH版)對EAFP在溶液中和在晶格中的分子能量的較為詳盡的分析表明，盡管兩種狀態(tài)下的EAFP分子骨架差別不大(主要是側(cè)鏈Arg殘基伸展方向不同)，但晶格中的EAFP分子采用較為有利的構(gòu)象，使結(jié)晶過程能夠順利進行；且沿結(jié)晶學(xué)不同方向上分子間的相互作用能(尤其是氫鍵能的差別)也不同，沿c方向上要比沿b方向上強約1/

9、3，這也與AFM結(jié)果分析相一致。 6.發(fā)現(xiàn)天花粉晶體所有表面上沒有螺旋位錯或臺階生長，只在其{001}面上發(fā)現(xiàn)明顯的非對稱線性的3D核進行生長。這些線性聚體均沿著晶體學(xué)〈110〉的方向進行排列，而且相互平行，這可說明天花粉分子間在這個方向上有著較強的相互作用，使得分子沿著這個方向容易進行聚集；對于GAFP晶體，原位實時動態(tài)的原子力顯微成像初步的研究發(fā)現(xiàn)在其晶體的{001}表面晶體生長較為緩慢，沒有發(fā)現(xiàn)臺階和螺旋位錯生長現(xiàn)象，而是