MUC1模擬表位疫苗篩選和治療小鼠膀胱癌效應(yīng).pdf

1、目的：從噬菌體隨機(jī)12肽庫中篩選新的MUC1的模擬表位，觀察其免疫學(xué)特性，以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答和對小鼠膀胱癌的治療作用。構(gòu)建MUC1模擬表位原核表達(dá)載體，獲得特異、純化的模擬表位融合蛋白。本研究為研制針對MUC1為靶點(diǎn)的腫瘤疫苗奠定基礎(chǔ)，為膀胱癌治療提供新方法。 方法：1.選用抗MUC1多肽表位的單克隆抗體BC2為篩選配基，利用噬菌體展示技術(shù)，從噬菌體隨機(jī)12肽庫中，通過3輪生物淘洗、測定噬菌體滴度、擴(kuò)增噬菌斑、挑選特

2、異性陽性噬菌體克隆，通過ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定陽性噬菌體克隆與單克隆抗體BC2結(jié)合活性；抽提陽性噬菌體克隆的插入肽ssDNA模板，測定其DNA序列，按遺傳密碼表推導(dǎo)出插入肽的氨基酸序列，同MUC1核心肽表位序列APDTR進(jìn)行比較，從中選出與原表位序列不同的模擬表位。利用表位預(yù)測專用數(shù)據(jù)庫SYFPEITHIdatabase進(jìn)行氨基酸序列的表位預(yù)測，根據(jù)抗原肽的基序特征計(jì)算其積分，判斷其與MHCⅠ類分子結(jié)合能力，合成相應(yīng)的模擬表位肽，通過競爭E

3、LISA實(shí)驗(yàn)判斷模擬表位肽能否特異性抑制單克隆抗體BC2與MUC1抗原結(jié)合，進(jìn)一步鑒定篩選出的MUC1模擬表位活性。2.利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法，將人MUC1全長cDNA轉(zhuǎn)入T739小鼠膀胱癌細(xì)胞BST739中，經(jīng)G418篩選和克隆化培養(yǎng)，基因組PCR、RT-PCR、免疫組化、流式細(xì)胞儀從不同水平檢測MUC1的表達(dá)，建立穩(wěn)定表達(dá)人MUC1T739小鼠膀胱癌細(xì)胞株，觀察轉(zhuǎn)入人MUC1腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外生長特性和體內(nèi)致瘤性。3.無菌取T73

4、9小鼠股骨和脛骨，PBS沖出骨髓細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，按2×106/ml的細(xì)胞密度加入含有樹突狀細(xì)胞(DC)專用培養(yǎng)基塑料培養(yǎng)皿，同時(shí)加入細(xì)胞因子rmGM-CSF，rmIL-41000U/ml，37℃，5％CO2體外培養(yǎng)，第6天加入LPS(1μg/ml)刺激DC成熟，第7天收集細(xì)胞，顯微鏡下觀察成熟DC形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測成熟DC標(biāo)記33D1單抗的表達(dá)以判斷DC純度。4.體外用合成的模擬表位肽刺激成熟DC，PBS洗滌三次，然后分

5、別用PBS，未刺激的DC，MUC1模擬表位肽刺激的DC，通過小鼠尾靜脈注射，免疫T739小鼠，每只注射2×105細(xì)胞，每周免疫一次，共三次。免疫結(jié)束后，分離小鼠血清和脾細(xì)胞，ELISA檢測小鼠血清產(chǎn)生的模擬表位抗原特異性抗體，ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)，Enzyme-LinkedImmunoSPOT)檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的活化的模擬表位特異性T細(xì)胞，以免疫后的小鼠活化T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以穩(wěn)定表達(dá)人MUC1T739小鼠膀胱癌細(xì)胞為靶

6、細(xì)胞，進(jìn)一步用非放射性乳酸脫氫酶法檢測不同效：靶比例時(shí)活化的模擬表位特異性T細(xì)胞體外細(xì)胞毒效應(yīng)。5.取對數(shù)生長期BST739-PC、BST739-MUC1細(xì)胞，分別皮下接種T739小鼠，2×106/只，建立皮下荷瘤鼠模型，觀察小鼠腫瘤生長情況，行免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織中MUC1表達(dá)及其分布特點(diǎn)。6.T739小鼠隨機(jī)分為4組，首先用BST739-MUC1細(xì)胞，分別皮下接種T739小鼠，2×106細(xì)胞/只，7天后第1組相同區(qū)域皮下注射等滲

7、鹽水0.2ml，第2組注射沒有肽刺激的空DC細(xì)胞懸液，第3組注射負(fù)載13號MUC1模擬表位肽的DC細(xì)胞懸液，第4組注射負(fù)載14號MUC1模擬表位肽的DC細(xì)胞懸液，2×105/只，1周后加強(qiáng)免疫1次，建立T739小鼠膀胱癌治療模型。治療過程中，每1～2日測量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，治療2周后，切取瘤組織稱瘤重，并觀察剩余小鼠存活期。7.依據(jù)模擬表位基因序列，選取Ecoli大腸桿菌偏好密碼子合成目的基因片段，合成目的基因片段進(jìn)行自連，選用最

8、大重復(fù)序列目的片段克隆入PET-31b(+)高效表達(dá)載體，克隆PCR和測序鑒定，選用插入最大目的片段的重組質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BLR(DE3)plysS，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得融合蛋白的高效表達(dá)，用Ni2+親和層析柱對目的蛋白進(jìn)行純化，收集純化蛋白樣品，Western印跡鑒定。 結(jié)果：1.從噬菌體隨機(jī)肽庫中篩選獲得兩個(gè)MUC1的模擬表位，能特異性與單克隆抗體BC2結(jié)合，同MUC1核心肽表位序列A

9、PDTR進(jìn)行比較，無同源性，表位預(yù)測顯示13號肽序列包含有與HLA-B*0702、HLA-B*08等MHCⅠ類分子較好結(jié)合的表位，14號肽序列包含有與HLA-A*0201、HLA-B*5101等MHCⅠ類分子較好結(jié)合的表位，預(yù)測分值均較高。合成的模擬表位肽能競爭抑制MUC1單克隆抗體與MUC1抗原的結(jié)合，兩個(gè)肽濃度為50ug/mL時(shí)幾乎完全抑制抗原抗體結(jié)合。2.建立穩(wěn)定表達(dá)人MUC1的T739小鼠膀胱癌細(xì)胞株，基因組PCR、RT-PCR

10、、免疫組化、流式細(xì)胞儀從DNA、mRNA和蛋白質(zhì)水平證實(shí)人MUC1基因整合在細(xì)胞基因組中并穩(wěn)定表達(dá)MUC1，MUC1主要表達(dá)于胞膜和胞漿，與親代細(xì)胞相比，BST739-MUC1體外生長特性無明顯改變。3.從T739小鼠骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)、培養(yǎng)出成熟DC，光鏡下觀察培養(yǎng)7天的成熟DC，可見具有典型的DC形態(tài)，流式細(xì)胞儀鑒定其純度為78.8％。4.ELISA檢測結(jié)果顯示兩個(gè)肽免疫的T739小鼠血清產(chǎn)生的特異性抗體活性明顯高于兩個(gè)PBS和DC+P

11、BS免疫后小鼠，相差非常顯著(p＜0.01)，表明兩個(gè)肽免疫的T739小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了MUC1特異性抗體。ELISPOT結(jié)果顯示，兩個(gè)肽免疫的T739小鼠特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)分別是92±10.5、106.5±12.8，而PBS和DC+PBS免疫后小鼠特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)均少于10，數(shù)量明顯少于前兩個(gè)組，表明兩個(gè)肽免疫的T739小鼠脾臟細(xì)胞中，產(chǎn)生了特異性活化的T淋巴細(xì)胞?；罨钠⑴K淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)檢測顯示效靶比

12、為25∶1開始顯示溶破效應(yīng)，當(dāng)效靶比為100∶1時(shí)兩個(gè)肽免疫的T739小鼠產(chǎn)生的活化T淋巴細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒功能，與PBS和DC+PBS免疫小鼠相比，相差非常顯著(p＜0.01)。5.兩組小鼠背部皮下注射BST739-PC細(xì)胞或BST739-MUC1細(xì)胞7天左右所有T739小鼠均生長出皮下腫瘤，成瘤率100％，兩組腫瘤生長情況無明顯差別，第30天以后小鼠開始陸續(xù)死亡，接種BST739-MUC1小鼠平均生存時(shí)間稍長于接種BST739小鼠。

13、免疫組化檢測結(jié)果同培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染BST739-MUC1細(xì)胞和BST739-PC細(xì)胞免疫組化檢測結(jié)果一致。6.在T739小鼠膀胱癌治療模型中，治療前各組之間的瘤體積大小基本保持一致，治療1周后，第1-4組腫瘤平均體積分別是690.7231±66.9365mm3，766.4980±150.7123mm3，514.8932±140.8419mm3，474.1843±81.5392mm3，與DC+PBS組和PBS組相比，以DC+肽免疫的兩組小鼠瘤體

14、積開始縮小，治療2周后，第1-4組腫瘤平均體積分別是2440.318±110.2717mm3，2361.863±265.4752mm3，1277.716±94.0457mm3，1043.940±72.8229mm3，兩組DC+肽免疫的小鼠瘤體積減小更加明顯，與DC+PBS組和PBS組相比差異非常顯著(p＜0.01)。治療2周后，第1-4組平均瘤重分別為2.942±0.34克，3.162±0.225克，1.728±0.295克，1.408

15、±0.215克，1、2組與3、4組相比差異非常顯著(p＜0.01)，第2-4組抑瘤率分別為6.96％、41.26％、52.14％，第1-4組荷瘤鼠的生存期分別為34.6±3.507天，35.2±3.564天，58.4±5.595天，59±6.819天，DC+肽免疫的兩組荷瘤小鼠生存期較PBS+DC組和等滲鹽水組明顯延長，差異有顯著性意義(p＜0.01)。7.磷酸化的目的基因片段直接退火自連后，凝膠電泳鑒定至少連上2個(gè)重復(fù)序列。PET-3

16、1b(+)質(zhì)粒去磷酸化并酶切，用最大重復(fù)序列目的片段與PET-31b(+)載體連接，克隆PCR和測序結(jié)果說明有兩個(gè)目的片段插入重組質(zhì)粒載體，選用此重組質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化高效表達(dá)菌BLR(DE3))plysS，在0.1mMIPTG，30℃，誘導(dǎo)3小時(shí)后，蛋白電泳見可13號和14號兩個(gè)MUC1模擬表位融合蛋白表達(dá)，表達(dá)蛋白的分子量與理論值(18×103D)相符，在0.5mMIPTG，37℃，誘導(dǎo)4-6小時(shí)，MUC1模擬表位融合蛋白在包涵體內(nèi)可得

17、理想表達(dá)。用Ni2+親和層析柱對目的蛋白進(jìn)行純化，15％SDS-PAGE電泳結(jié)果可見清晰特異性蛋白條帶，Westernblot檢測，MUC1模擬表位顯色條帶與SDS-PAGE電泳圖純化蛋白位置相對應(yīng)，證明所表達(dá)蛋白的特異性，并具有良好的抗原性。 結(jié)論：篩選到兩個(gè)MUC1的模擬表位，建立了穩(wěn)定表達(dá)人MUC1的小鼠膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株及相關(guān)腫瘤模型。負(fù)載兩個(gè)模擬表位肽的DC免疫小鼠，體內(nèi)外均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，在