不同環(huán)境條件下水稻土硝酸鹽還原過程及其功能微生物特征.pdf

1、水稻是重要的糧食作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。水稻田由于獨(dú)特的耕作管理制度，大部分時(shí)間處于淹水狀態(tài)，并伴有間歇性落干，長期干濕交替導(dǎo)致水稻土氧化還原反應(yīng)活躍。同時(shí)，水稻根際的泌氧作用也使得稻田土壤長期處于有氧/無氧并存的狀態(tài)，既利于硝化作用過程發(fā)生，也利于硝酸鹽還原過程，使得其中氮元素的氧化還原反應(yīng)劇烈。稻田土壤中過量的氮肥投入可通過硝酸鹽還原過程如厭氧銨氧化作用和反硝化作用還原產(chǎn)生N2，反硝化過程中還可能釋放強(qiáng)效應(yīng)的溫室氣體N2

2、O，導(dǎo)致氮素大量損失和溫室氣體排放。
　　研究驅(qū)動(dòng)水稻土中硝酸鹽還原作用的環(huán)境影響因子及相關(guān)微生物學(xué)機(jī)理，對(duì)于提高稻田氮肥利用效率，減少氮對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響有重要意義。因此，在本研究中沿濱海向內(nèi)陸方向采集了一系列代表不同鹽度、pH、有機(jī)碳水平的水稻土64份，通過15N標(biāo)記技術(shù)結(jié)合定量PCR、克隆測(cè)序和Illumina Miseq高通量測(cè)序等分子生態(tài)學(xué)技術(shù)研究方法，研究不同環(huán)境條件下反硝化作用和厭氧銨氧化過程的反應(yīng)速率及其參與這兩個(gè)過

3、程的功能基因的變化特征。在此基礎(chǔ)上，通過室內(nèi)模擬培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，深入探討了3個(gè)代表性土壤中硝酸鹽還原過程及其關(guān)鍵功能基因的相互關(guān)系。取得結(jié)果如下:
　　1)對(duì)野外樣品的同位素示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試水稻土中厭氧銨氧化作用(Anammox)活性較低，速率為0-0.479 nmol N g-1干重h-1，且在部分樣品中無法檢測(cè)得到，該過程對(duì)N2產(chǎn)生的相對(duì)貢獻(xiàn)率為0-12.9％。反之，反硝化過程反應(yīng)速率在0.84-31.314nmol N g-

4、1干重h-1之間，對(duì)N2產(chǎn)生的貢獻(xiàn)率87.1％-100％，表明反硝化作用是水稻土N2損失的主要途徑。對(duì)Anammox細(xì)菌16SrRNA基因和功能基因hzsB的克隆測(cè)序分析表明，所有樣品中Anammox細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為單一，只有一個(gè)優(yōu)勢(shì)種群，Candidatus Scalindua屬主要分布在高鹽高pH的沿海灘涂沉積物(TT)樣點(diǎn)中，而其他土壤樣品以Candidatus Brocadia屬為主。冗余分析(Redundancy analys

5、is，RDA)表明厭氧銨氧化細(xì)菌群落組成與pH、C/N、含水量以及EC顯著相關(guān)。
　　2)對(duì)野外樣品的硝化、反硝化潛勢(shì)及其功能基因定量分析顯示，水稻土的硝化與反硝化潛勢(shì)都很高，且表層土壤高于亞表層土壤;古菌-nirK基因的豐度在隨著鹽分含量降低而降低，在海邊灘涂沉積物表層沉積物（參照樣品）中最高，達(dá)2.42×108 copies g-1干重，在濱海鹽漬土壤中約2.73×105-2.49×107 copies g-1干重，而在內(nèi)陸水

6、稻土中甚至檢測(cè)不到。與之相反，細(xì)菌nirK基因在所有土樣中均有分布，豐度在1.23×107-7.36×107 copies g-1干重。古菌nirK基因豐度與pH、EC呈正相關(guān)關(guān)系，與DEA呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而細(xì)菌nirK基因豐度與NH4+、DOC、DON和DEA都呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，表明古菌參與的反硝化作用只在高pH、高EC的環(huán)境才起到主導(dǎo)作用?？寺y(cè)序分析表明AnirK基因序列都屬于奇古菌門，且水稻土來源的nirK基因序列與濱海沉積物和濕地

7、樣品序列相距較遠(yuǎn)，pH和EC是影響奇古菌門-nirK基因組成差異的主要因子。細(xì)菌nirK基因Miseq測(cè)序研究結(jié)果表明，水稻土樣品的nirK基因多樣性更高，表層土壤豐富度更高，其中TT、SY和FQ這3個(gè)高鹽高pH樣點(diǎn)主要以Bacteria_ unclassified的細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)該菌群在其他水稻土中也占有30％左右的豐度，而其他水稻土中主要以根瘤菌目和變形菌綱占優(yōu)勢(shì)，pH和EC也是細(xì)菌nirK基因分布的主要環(huán)境因子。
　　

8、3)為進(jìn)一步驗(yàn)證含nirK基因的古菌在反硝化作用中的活性及影響其活性的關(guān)鍵因素，我們選取了代表高鹽高pH的灘涂沉積物(TT)和代表中、低鹽分和pH的2個(gè)水稻土(FQ，HZ)進(jìn)行微宇宙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:三種土壤的反硝化活性表現(xiàn)為FQ＞TT＞HZ，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加反硝化速率下降;飽和含水量條件下，樣品中反硝化活性顯著高于淹水處理。對(duì)應(yīng)地，古菌-nirK基因在FQ樣品中最高，TT中次之，而在HZ樣品中檢測(cè)不到，且在飽和含水量條件下顯著

9、高于淹水處理?xiàng)l件;反硝化速率與古菌-nirK基因豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，但與細(xì)菌nirK基因呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明古菌在FQ和TT樣品的反硝化作用中起重要貢獻(xiàn)。在培養(yǎng)過程中，HZ土壤樣品的硝態(tài)氮累積和N2O產(chǎn)生明顯低于FQ和TT，NH4+含量顯著高于FQ和TT，表明培養(yǎng)過程中可能發(fā)生了硝酸鹽異化還原成銨作用。古菌-nirK基因的群落組成與野外樣品調(diào)查結(jié)果相一致，AnirK都?xì)w屬于奇古菌門下，其中ClusterⅠ和Ⅱ主要是來自水稻土FQ樣品，