重組生長(zhǎng)激素（rhGH）對(duì)放射性小腸黏膜損傷的修復(fù)作用.pdf

1、研究背景 自從放射治療技術(shù)應(yīng)用于臨床，放療導(dǎo)致的急性胃腸道并發(fā)癥一直引起醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。在八十年代的國(guó)內(nèi)外報(bào)道中，放射性腸炎的發(fā)生率一直很高。近年來雖然醫(yī)療技術(shù)有很大進(jìn)步，但放射性腸炎的發(fā)生仍然十分常見。 放射性損傷是由于放射線使原來穩(wěn)定的細(xì)胞更新系統(tǒng)中增殖活躍的細(xì)胞減少而造成的。有絲分裂活躍的細(xì)胞對(duì)放射也最為敏感，治療劑量放射后數(shù)小時(shí)就可以觀察到腸黏膜發(fā)生異常的變化。腸黏膜細(xì)胞數(shù)量減少，絨毛變短，吸收面積縮小，隨后白細(xì)胞

2、浸潤(rùn)，隱窩膿腫形成，上皮細(xì)胞死亡脫落，形成局灶性潰瘍。同時(shí)腸道出現(xiàn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收不良和代謝障礙。 放射性損傷通過影響腸上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)骨架蛋白的變化，引起細(xì)胞形態(tài)改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和腸黏膜屏障功能受損。所以，通過檢測(cè)腸上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中骨架蛋白的表達(dá)，可以間接了解腸黏膜屏障功能是否正常。在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，腸上皮細(xì)胞中骨架蛋白的表達(dá)通常被設(shè)為觀察指標(biāo)，但間質(zhì)細(xì)胞中的骨架蛋白變化少有提及。 在腸黏膜發(fā)生損傷時(shí)

3、，腸上皮細(xì)胞發(fā)生增殖和自我修復(fù)，有關(guān)細(xì)胞增殖情況的檢測(cè)目前大量研究都采用了細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)這一指標(biāo)。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，小腸干細(xì)胞是腸黏膜受損傷后上皮細(xì)胞修復(fù)的主要細(xì)胞來源，但一直以來由于缺乏特異的標(biāo)記物而無(wú)法對(duì)小腸干細(xì)胞的增殖分化情況進(jìn)行觀察。最近研究證實(shí)，腸道上皮Musashi-1蛋白表達(dá)的部位與干細(xì)胞的部位具有非常良好的一致性，提示Musashi-1可作為小腸干細(xì)胞鑒定的重要標(biāo)志之一。 生長(zhǎng)激素(grow horm

4、one，GH)可以通過影響腸黏膜隱窩細(xì)胞分裂周期及增加細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)腸絨毛生長(zhǎng)和修復(fù)。有關(guān)其作用機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，生長(zhǎng)激素可以通過刺激細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞的增生、提高腸黏膜細(xì)胞谷氨酰胺酶的活性，增加機(jī)體對(duì)谷氨酰胺的攝取和利用，還能夠上調(diào)應(yīng)激狀態(tài)下腸黏膜細(xì)胞蛋白質(zhì)mRNA的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)對(duì)腸黏膜損傷的修復(fù)。鑒于目前小小鼠小腸黏膜損傷模型報(bào)道較少，黏膜損傷后的修復(fù)機(jī)制不明。本研究采用不

5、同放射劑量的射線對(duì)小鼠進(jìn)行放射性損傷，通過HE染色、細(xì)胞凋亡檢測(cè)和免疫組化方法檢測(cè)放射后小鼠小腸黏膜的一些損傷和修復(fù)指標(biāo)的變化，觀察建立小鼠放射損傷模型的可行性；在此基礎(chǔ)上，觀察重組重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)對(duì)放射損傷后小腸黏膜的修復(fù)作用及其可能機(jī)制。 研究目的 1.觀察小腸黏膜形態(tài)學(xué)改變，以及α-SMA、PCK、PCNA、Musashi-1在小腸黏膜表達(dá)的變化，了解小鼠小腸黏膜放射性損傷時(shí)的特點(diǎn)； 2.觀察rh

6、GH治療后各項(xiàng)指標(biāo)的變化，為進(jìn)一步研究小腸損傷的組織修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究對(duì)象與方法 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)用雄性昆明小鼠，8周齡，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。60只雄性小鼠，體重20～25g，隨機(jī)分為6組，每組10只。空白組，不接受放射。模型組(包括ABC三組)，分別給予8Gy、12Gy、16Gy的劑量放射?？瞻捉M和模型組均于接受放射后12h處死，取小腸標(biāo)本，固定后石蠟包埋切片，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。治療組，于接

7、受12Gy劑量放射12h后開始給予重組人生長(zhǎng)激素(rhGH，瑞士雪蘭諾大藥廠)治療，rhGH的每次用量為0.8IU/Kg，腹腔內(nèi)注射，從12h開始到36h之間每間隔12h注射一次；對(duì)照組，也接受12Gy劑量放射并在治療組注射rhGH同時(shí)向腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水，90小時(shí)后將治療組和對(duì)照組處死，取小腸標(biāo)本，固定后常規(guī)石蠟包埋切片，觀察生長(zhǎng)激素對(duì)小腸黏膜修復(fù)的作用。 2、放射性腸炎模型的建立 實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)用0.5﹪成巴比妥鈉腹

8、腔內(nèi)注射麻醉后，仰臥位固定四肢，用X射線進(jìn)行一次性腹部照射。照射部位為小鼠劍突下0.2cm至髂脊上緣連線中點(diǎn)，厚度為1cm；劑量率為2Gy/min，總劑量分別為8Gy、12Gy、16Gy，照射源至動(dòng)物中心距離為1m。 3、實(shí)驗(yàn)研究方法 (1) HE染色進(jìn)行小腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察。 (2) 小腸上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)測(cè)定，采用TUNEL染色法。 (3) 用免疫組化方法，檢測(cè)α-SMA、PCK、PCNA、Musash

9、i-1在小腸黏膜的表達(dá)水平。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比進(jìn)行評(píng)分。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多組問資料的比較采用方差分析，顯著性水準(zhǔn)為0.05。 結(jié)果 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)食情況及處死后小腸的肉眼觀察及rhGH治療的影響在接受放射后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)減少，以接受16Gy照射小鼠最為明顯，12Gy組和16Gy組部分小鼠出現(xiàn)腹部照射區(qū)域脫毛

10、情況，而16Gy組小鼠在照射后12h內(nèi)其中2只自然死亡。12h后處死取腸，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腸腔內(nèi)無(wú)明顯食物殘留。肉眼觀察8Gy組小腸外觀與空白組無(wú)明顯差別，12Gy組及16Gy組小腸出現(xiàn)充血，以后者為嚴(yán)重。 治療組和對(duì)照組小鼠處死前均能正?；顒?dòng)飲食，腸腔內(nèi)明顯食物殘留，小腸充血不明顯。 2.小腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察及rhGH治療的影響空白組小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，絨毛排列整齊。模型組小腸黏膜明顯水腫，腸絨毛增粗，縮短或長(zhǎng)短不一，上

11、皮細(xì)胞壞死脫落，部分絨毛缺損。腸腔內(nèi)見大量脫落、壞死的上皮細(xì)胞。 治療組和對(duì)照組上述病理改變明顯減輕，腸黏膜上皮基本完整。 3.在各組中的細(xì)胞凋亡情況及rhGH治療的影響模型組中的細(xì)胞凋亡指數(shù)隨放射劑量增大而增加，模型組和空白組各組問統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。 治療組的細(xì)胞凋亡指數(shù)較對(duì)照組明顯減低，有顯著性差異(P<0.05)。 4．α-SMA在各組中的表達(dá)情況及rhGH治療的影響α-SMA

12、在模型組中的表達(dá)水平隨放射劑量增大而降低，模型組和空白組各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。 治療組的表達(dá)高于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)。 5.PCK在各組中的表達(dá)情況及rhGH治療的影響PCK在模型組中的表達(dá)隨著放射劑量增大而降低，模型組和空白組各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。 治療組的表達(dá)高于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)。 6.PCNA在各組中的表達(dá)情況及rh

13、GH治療的影響PCNA在模型組中的表達(dá)隨放射劑量增大而升高，各相鄰組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但相間隔兩組間差異顯著(P<0.05)。 治療組的表達(dá)高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P<0.05)。 7.Musashi-1在各組中的表達(dá)情況及。rhGH治療的影響Musashi-1在空白組呈低表達(dá)，16Gy模型組的表達(dá)較空白組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 治療組的表達(dá)高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯

14、著性差異(P<0.05)。 小結(jié) 1.在模型組中，隨著放射劑量增大，小腸黏膜絨毛長(zhǎng)度縮短，隱窩深度變淺。使用rhGH后，小腸黏膜損傷程度減輕。 2.小腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)隨放射劑量增大而增加；使用rhGH后，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降。 3.模型組中α-SMA、PCK隨放射劑量增大表達(dá)減低；使用rhGH后，表達(dá)較對(duì)照組增加。 4.在模型組中，PCNA和Musashi-1隨放射劑量增大表達(dá)增加；使用rhGH