外加電場干預(yù)對體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞部分生物學行為的影響.pdf

1、背景和目的:血管損傷后新生內(nèi)膜形成是血管再狹窄(restenosis,RS)等病變的病理基礎(chǔ),嚴重影響了經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)的遠期療效,因而對RS的防治成為心血管病領(lǐng)域研究的重要課題.RS發(fā)生是一個復雜的過程,球囊損傷,局部血管內(nèi)膜撕裂,加之繼發(fā)的炎癥刺激,使局部血管組織細胞的生物學特性發(fā)生改變,損傷的內(nèi)膜創(chuàng)面不能及時修復,中膜層血管平滑肌細胞(vascul

2、ar smooth muscle cells,VSMCs)通過損傷的內(nèi)彈力層向內(nèi)膜下遷移,并發(fā)生增殖,最后導致增生的新生內(nèi)膜形成.有效干預(yù)損傷局部血管組織細胞的生物學行為,促進內(nèi)皮細胞修復,抑制VSMCs向內(nèi)膜下的遷移,是RS防治研究的重要內(nèi)容之一.對胚胎發(fā)育中組織形成、炎癥反應(yīng)及損傷修復的細胞生物學研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),局部組織或細胞存在著內(nèi)生性電場(electirc fields,Efs),這一Efs正常時處于一種動態(tài)平衡狀態(tài).在一定因素作

3、用下,如處于組織的胚胎發(fā)育期、損傷及炎癥因子作用等,可改變局部的電場平衡,形成電位差,使細胞定向、有序生長,是最終形成組織或修復組織的一個重要條件.關(guān)于Efs對細胞生物學行為影響的進一步研究表明,在Efs作用下,細胞順Efs方向進行恰當?shù)内吇\動,在胚胎期主要是形成組織和器官,而在成年動物則主要參與組織的損傷修復.血管RS的發(fā)生中,VSMCs通過損傷的彈力纖維層向內(nèi)膜下遷移并發(fā)生增殖是其關(guān)鍵因素之一,因此,對RS發(fā)生中有關(guān)細胞生物學行為

4、的干預(yù)和調(diào)節(jié)就是其防治的最關(guān)鍵環(huán)節(jié).局部Efs對細胞的生物學行為有著明顯影響,使細胞定向遷移,那么,可不可以通過外加局部Efs的方式,在血管RS的防治中應(yīng)用Efs的這一作用呢?該課題擬設(shè)計制作體外干預(yù)Efs發(fā)生裝置,利用該裝置作用于培養(yǎng)的大鼠VSMCs,研究Efs對VSMCs遷移、增殖行為的影響,以及Efs影響細胞運動的發(fā)生和調(diào)控機制.為調(diào)控VSMCs遷移行為尋找新的方法和技術(shù).方法:(1)參考國外文獻報道,改進外加Efs干預(yù)裝置,包括

5、電源、電極系統(tǒng)、細胞培養(yǎng)室,可以模擬生理Efs,作用于培養(yǎng)的VSMCs,并能在顯微鏡下動態(tài)觀察細胞行為的改變.(2)采用膠元酶消化法培養(yǎng)大鼠主動脈VSMCs,較早期傳代細胞用于實驗.(3)采用Efs干預(yù)培養(yǎng)的VSMCs,細胞置于顯微鏡培養(yǎng)條件或細胞培養(yǎng)箱中.CCD間斷顯微細胞圖象記錄和分析,研究不同強度Efs、不同作用時間對VSMCs遷移和細胞形態(tài)的影響.采用免疫細胞化學染色方法觀察Efs作用后VSMCs PCNA表達情況,研究細胞增殖

6、改變.(4)CCD間斷顯微細胞圖象記錄和分析,研究不同細胞生長因子、不同濃度AngⅡ參與情況下,Efs對VSMCs遷移行為的影響.(5)采用免疫細胞化學或免疫熒光染色方法檢測Efs干預(yù)后,與VSMCs遷移密切相關(guān)的PDGFR、AT1R和AT2R等受體的表達情況,研究Efs影響VSMCs發(fā)生的機制.(6)采用激光共聚焦技術(shù)檢測Efs干預(yù)后,與細胞運動行為有關(guān)的肌動蛋白細胞骨架F-actin的表達,研究Efs作用的可能機制.結(jié)果:(1)改進

7、并制作Efs干預(yù)裝置,使電源可以輸出微安級強度的直流Efs,精確可調(diào),模擬生理Efs;電極系統(tǒng)具有良好的導電性,可避免電極電解產(chǎn)物進入培養(yǎng)基,保持培養(yǎng)基的穩(wěn)定性;細胞培養(yǎng)室明顯提高局部電阻,最大限度保證局部環(huán)境穩(wěn)定,減少生理Efs的電流和歐姆熱,可以保證細胞在培養(yǎng)條件下長期存活,并能在顯微鏡下觀察細胞行為.以上條件保證Efs干預(yù)條件穩(wěn)定可靠,可用于Efs影響VSMCs行為的研究.(2)采用膠元酶消化法進行大鼠主動脈VSMCs的原代培養(yǎng),

8、所得細胞形態(tài)和生長穩(wěn)定,經(jīng)形態(tài)學和α-SM-actin免疫細胞化學染色鑒定證實為VSMCs,采用較早期傳代細胞進行研究.(3)在含有10﹪FBS的培養(yǎng)基中,細胞在Efs作用下顯示明顯的趨化反應(yīng).在100~250mV/mm Efs中,細胞向陰極遷移.對單個細胞和細胞團,在150mV/mm,細胞定向遷移的速度沒有明顯提高.150mV/mm Efs長時間作用于培養(yǎng)的VSMCs,細胞向陰極遷移的距離明顯高于無Efs作用對照組,細胞向陽極遷移受到

9、抑制.Efs作用下,部分細胞的片狀偽足向陰極面伸展.細胞向陰極遷移,需要培養(yǎng)基中血清存在.在無血清的培養(yǎng)基中,細胞在250mV/mm Efs中沒有定向遷移.(4)150mV/mm Efs長時間作用于培養(yǎng)的VSMCs,在24、48、72小時,細胞PCNA表達與對照培養(yǎng)細胞未見明顯差異.(5)在無血清培養(yǎng)基中補充PDGF-BB、bFGF、TGF-β1時,部分恢復細胞向陰極遷移.其中PDGF-BB的作用較強,與DMEM培養(yǎng)VSMCs相比,DM

10、EM + PDGF-BB培養(yǎng)VSMCs向陰極遷移明顯增強,但仍然低于DMEM +10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs.bFGF和TGF-β1作用類似.(5)在150mV/mmEFs中,DMEM +10﹪FBS +10<'-6>、10<'-7>mol/L AngⅡ培養(yǎng)VSMCs明顯向陰極遷移,與DMEM +10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs相差顯著.DMEM+10<'-6>、10<'-7>mol/L AngⅡ培養(yǎng)VSMCs在Efs中遷移速度增加,沒有定向改

11、變.(6)Efs 150mV/mm,干預(yù)DMEM+10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs ,細胞內(nèi)PDGFR表達增加,部分細胞內(nèi)PDGFR表現(xiàn)為不對稱分布,集中在細胞朝向Efs陰極面的胞漿中.PDGFR上調(diào)在Efs作用5分鐘即出現(xiàn),可持續(xù)6小時.(7)Efs 150mV/mm,干預(yù)DMEM+10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs ,細胞內(nèi)AT1R表達增加,可持續(xù)6小時以上,沒有發(fā)生細胞不對稱分布.AT2R表達沒有改變.(8)EFs150mV/mm,干預(yù)DMEM

12、+10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs,激光共聚焦顯微鏡顯示Efs作用5分鐘,胞漿內(nèi)F-actin分布即開始改變,逐漸呈平行排列,形成整齊的應(yīng)力纖維絲.定量分析顯示Efs作用使細胞內(nèi)F-actin表達增加,30~60分鐘達到高峰,以后F-actin表達仍然高于正常對照.結(jié)論:(1) 改進制作體外Efs干預(yù)裝置:微安級精確調(diào)控穩(wěn)壓穩(wěn)流電源、可施加Efs干預(yù)的體外培養(yǎng)細胞用細胞培養(yǎng)槽.可以模擬體內(nèi)生理Efs作用,適應(yīng)實驗需要.(2)外加直流Efs干預(yù)

13、下,大鼠VSMCs發(fā)生形狀改變和定向遷移.細胞膜向陰極方向伸展,分散細胞和細胞團在Efs中遷移相似.定向遷移依賴于Efs強度.(3) 生理強度的直流Efs對VSMCs增殖沒有明顯影響.(4)Efs誘導的VSMCs定向遷移依賴于血清的存在,血清中的生長因子與Efs協(xié)同作用,促進細胞向陰極遷移. (5)Efs作用下,細胞PDGFR表達上調(diào)和細胞內(nèi)重分布,可能與細胞定向遷移的啟動和維持有關(guān).(6) AngⅡ提高Efs中VSMCs遷移的速度,但