微絲骨架Actin介導(dǎo)的擬南芥免疫反應(yīng)及其抗小麥條銹病機(jī)制研究.pdf

1、微絲骨架作為真核細(xì)胞中動(dòng)態(tài)變化的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在植物感知和抵抗病原菌侵染中發(fā)揮重要作用。微絲骨架參與植物的免疫反應(yīng)，但其如何參與免疫信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，目前所知甚少。小麥條銹病是由條形柄銹菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引起的小麥生產(chǎn)上危害嚴(yán)重的一種真菌病害，但是小麥抗條銹病機(jī)制研究尚不完全清楚。因此，從模式植物擬南芥以及小麥重要病害條銹病入手，研究微絲骨架actin（肌動(dòng)蛋白）介導(dǎo)的植物免疫機(jī)制，對(duì)全

2、面了解微絲骨架參與擬南芥免疫機(jī)制，以及進(jìn)一步闡明小麥與條銹菌互作的分子機(jī)理，具有重要意義。
　　本研究以擬南芥和小麥作為研究對(duì)象，主要通過(guò)微絲骨架熒光標(biāo)記、酵母雙雜交、免疫共沉淀、蛋白磷酸化、病毒誘導(dǎo)基因沉默、LC/MS(liquid chromatography/massspectrometry，液相色譜/質(zhì)譜)技術(shù)和MAPK（mitogen-activated protein kinase，絲裂原活化蛋白激酶）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法

3、，篩選與微絲骨架肌動(dòng)蛋白ACT7互作蛋白，對(duì)擬南芥微絲骨架肌動(dòng)蛋白ACT7、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白CAP1和小麥肌動(dòng)蛋白解聚因子ADF4的功能進(jìn)行了深入研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.對(duì)擬南芥cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，選出24個(gè)與ACT7互作的蛋白，其中包括actin結(jié)合蛋白ADF1、ADF4和ARPC3等，與植物免疫相關(guān)的RIN4、ROC4、LOS2蛋白，以及CAP1等多個(gè)目前在植物免疫中功能尚不清楚的蛋白。利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技

4、術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了ACT7與RIN4、CAP1的蛋白相互作用。
　　2.利用擬南芥-丁香假單胞菌模式互作系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)ACT7和CAP1參與DC3000和DC3000AvrRpm1引起的擬南芥免疫反應(yīng)，ACT7負(fù)調(diào)控?cái)M南芥抗病性，CAP1正調(diào)控?cái)M南芥抗病性。與野生型Col-0相比，act7-2突變體抑制DC3000繁殖，相反cap1突變體促進(jìn)DC3000大量繁殖。cap1突變體產(chǎn)生嚴(yán)重壞死斑，act7-2突變體幾乎無(wú)壞死斑產(chǎn)生。與野生型

5、Col-0相比，act7-2突變體抑制DC3000AvrRpm1生長(zhǎng)，壞死面積降低，表現(xiàn)更為抗病;cap1突變體促進(jìn)DC3000AvrRpm1生長(zhǎng)，抑制HR反應(yīng)，壞死面積增加，表現(xiàn)更為感病。
　　3.利用flg22誘導(dǎo)的MAPK實(shí)驗(yàn)，證明突變CAP1顯著抑制flg22誘導(dǎo)的MAPK3/MAPK6的積累，而突變ACT7促進(jìn)flg22誘導(dǎo)的MAPK3/MAPK6的積累。與對(duì)照相比，flg22處理后10 min，cap1突變體中MAPK

6、3/MAPK6積累量顯著降低;act7-2中MAPK3/MAPK6積累量升高。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PTI信號(hào)途徑marker基因FRK1在act7-2突變體中顯著上調(diào)表達(dá);在cap1突變體中顯著抑制表達(dá)。表明ACT7和CAP1參與flg22誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)PTI途徑。
　　4.采用Phos-tag技術(shù)對(duì)DC3000AvrRpm1誘導(dǎo)RIN4在act7-2和cap1突變體中磷酸化情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，ACT7

7、突變后，RIN4磷酸化被促進(jìn)并增強(qiáng)，而RIN4磷酸化在CAP1突變后受到抑制。接種病原菌DC3000AvrRpm1后，act7-2中RIN4積累量顯著降低，而cap1中RIN4的積累卻未降低。qRT-PCR分析顯示，ETI免疫相關(guān)基因RPM1、PR1以及WRKY70在ACT7突變后表達(dá)量升高，在CAP1突變后表達(dá)量顯著降低。表明ACT7和CAP1參與RIN4介導(dǎo)的擬南芥ETI免疫信號(hào)途徑。
　　5.從小麥cDNA文庫(kù)中，克隆了6個(gè)

8、小麥ADF基因，分別命名為T(mén)aADF3、TaADF4、TaADF5、TaADF6、TaADF8和TaADF11。酵母雙雜交及免疫共沉淀結(jié)果，證明TaADF4與TaACT1、AtADF4與AtACT7直接互作，同時(shí)TaADF4與AtACT7、AtADF4與TaACT1交叉互作。蛋白三維結(jié)構(gòu)建模，TaADF4與AtADF4蛋白模型幾乎完全重合，表明TaADF4和AtADF4結(jié)構(gòu)功能相似。小麥ADFs與TaACT1特異性互作分析顯示，TaAD

9、F8不與TaACT1互作，且TaADF8蛋白結(jié)構(gòu)模型獨(dú)立于另外5個(gè)小麥ADF蛋白結(jié)構(gòu)模型，表明不同的小麥ADFs可能存在功能特異性。激光共聚焦顯微觀察，發(fā)現(xiàn)TaADF4-RFP與TaACT1-GFP熒光標(biāo)記蛋白信號(hào)共定位于微絲骨架。蛋白磷酸化實(shí)驗(yàn)，證明AtADF4和TaADF4活性被CPK3磷酸化調(diào)節(jié)。
　　6.qRT-PCR分析顯示，TaADF4參與小麥生物與非生物應(yīng)答，TaADF4被高溫、茉莉酸甲酯和脫落酸誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，鹽和低

10、溫顯著抑制其表達(dá)。TaADF4在小麥與條銹菌CYR23非親和互作中表達(dá)量顯著高于小麥與條銹菌CYR31親和互作。利用VIGS技術(shù)沉默TaADF4后，小麥對(duì)條銹菌CYR23的抗性降低。LatB處理微絲骨架誘導(dǎo)TaADF4上調(diào)表達(dá)，抑制條銹菌菌絲生長(zhǎng)，促進(jìn)活性氧的積累和過(guò)敏性壞死。利用LC/MS技術(shù)，對(duì)植物激素JA(jasmonic acid茉莉酸)和SA（salicylic acid水楊酸）的積累進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示TaADF4沉默后，JA

11、的積累量較對(duì)照組明顯降低。以上結(jié)果證明，TaADF4通過(guò)參與小麥JA信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，積極調(diào)節(jié)小麥對(duì)條銹菌小種CYR23的抗性作用。
　　綜上所述，本研究進(jìn)一步解析了微絲骨架在植物免疫過(guò)程中的重要作用，首次發(fā)現(xiàn)并證明了微絲骨架肌動(dòng)蛋白ACT7和環(huán)化酶相關(guān)蛋白CAP1，參與flg22誘導(dǎo)的MAPK擬南PTI信號(hào)途徑和RIN4介導(dǎo)的ETI信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最后探索了小麥肌動(dòng)蛋白解聚因子TaADF4在小麥抵抗條銹病侵染過(guò)程中的作用，為全面了解植