腸道粘附菌群穩(wěn)態(tài)作為魚類健康評估指標的探究.pdf

1、動物腸道黏膜表面時時都暴露于復(fù)雜和動態(tài)的微生物群落之中，因此，腸黏膜層的主要功能之一是作為抵抗駐留在腸腔中的大量細菌的屏障。然而，研究者往往只關(guān)注到了黏膜層上皮細胞以及他們之間的緊密連接結(jié)構(gòu)，卻常常遺忘和忽視了一個重要的防御系統(tǒng)，那就是粘液層，這一層就是微生物-宿主互作、相互影響的最初接觸面。微生物與宿主腸道共同進化形成相互有效的適應(yīng)機制，并且在不同腸道區(qū)域呈現(xiàn)出不同的特點。研究宿主腸道、粘液蛋白以及微生物互作過程中的特點以及關(guān)系，對更

2、好的理解微生物與宿主互作提供了基礎(chǔ)，為水產(chǎn)動物腸道健康研究以及發(fā)掘新的益生菌都具有重要意義。本論文首先通過蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及16S測序技術(shù)分別對模式動物斑馬魚的腸道粘液、腸道本身、腸道粘液粘附菌群按照斑馬魚腸道自然折疊分段進行了全面透徹的研究，發(fā)掘魚類腸道不同區(qū)域的功能、與腸道健康相關(guān)的蛋白、基因以及粘附菌群分布差異及特點，揭示腸道粘附微生物穩(wěn)態(tài)對于腸道以及宿主健康的重要性。最后嘗試以經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類代表羅非魚為例說明實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中腸

3、道粘附菌群作為腸道健康評價指標的實際應(yīng)用以及評價意義。主要結(jié)論如下:
　　1.通過對正常養(yǎng)殖斑馬魚腸道從前至后自然分為三段的順序進行粘液染色，發(fā)現(xiàn)斑馬魚腸道粘液在不同區(qū)域的厚度不一致，但是都只有一層，按照中腸、前腸、后腸的順序逐漸降低。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定篩選差異蛋白，中腸與前腸比較有353個，后腸與前腸比較有329個，但是后腸與中腸的比較只有201個，說明前腸差異蛋白的數(shù)目最多;隨后進行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，不同腸道區(qū)域的顯著差異

4、蛋白根據(jù)功能多涉及到營養(yǎng)代謝通路，表明主要差異蛋白與營養(yǎng)相關(guān)。最后經(jīng)過篩選獲得具有不同黏膜屏障功能的蛋白分布，發(fā)現(xiàn)在不同腸道區(qū)域分別與機械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障以及微生物屏障相關(guān)的粘蛋白分布特點，揭示不同腸道區(qū)域粘液采用不同的屏障策略。
　　2.轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)比較正常養(yǎng)殖斑馬魚前中后腸差異表達基因，后腸相對于前腸以及中腸具有更大的差異，無論是顯著性上調(diào)還是下調(diào)的基因都在后腸數(shù)量上顯著高于前腸與中腸，說明在表達模式上后腸的差異性。通

5、路富集分析后，在前腸與中腸之間的顯著差異基因一共被注釋到8個具有顯著差異的通路，在后腸與前腸以及后腸與中腸之間的比較分別具有23個和24個顯著差異的通路，其中18個是共同的通路，這也更加說明了后腸的功能差異性。經(jīng)過篩選與腸道健康相關(guān)的基因，我們發(fā)現(xiàn)與腸道免疫進程以及腸道上皮發(fā)育相關(guān)的基因多分布于后腸，前腸相對較少，最少的是中腸，說明腸道在不同區(qū)域的免疫調(diào)節(jié)功能以及細胞屏障功能的差異。但是具有調(diào)節(jié)粘液分泌以及腸上皮分化的基因gata5在中

6、腸最豐富，與腸道粘液的厚度存在很大的相關(guān)性，暗示這一基因在腸道中與粘液屏障的正向關(guān)系。
　　3.16S測序技術(shù)比較正常養(yǎng)殖斑馬魚前中后腸粘液粘附菌群特點。從整體結(jié)構(gòu)上來看，斑馬魚前中后腸的粘液粘附菌群存在明顯的差異，前腸與后腸具有更加相似的結(jié)構(gòu)。不同部位主要以變形菌門(Proteobacteria)為主，隨后是梭桿菌門(Fusobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，相對比例存在顯著性不同。在屬水平上，除去“unkn

7、own”的部分，鯨桿菌屬（Cetobacterium）和鄰單胞菌屬（Plesiomonas）占有主要地位，其中鯨桿菌屬（Cetobacterium）在前中后腸的不同部位體現(xiàn)出顯著性的豐度差異，在中腸的相對豐度最大，達到31.35±1.21％，前腸以及后腸分別為8.67±0.50％和13.14±3.43％。鏈球菌屬（Streptococcus）和乳球菌屬（Lactococcus）在前腸豐度最高沿著腸道延伸往后逐漸下降，在中后腸無差異;假單

8、胞菌屬（Pseudomonas）和希瓦氏菌屬（Shewanella）在前中腸相對豐度無差異，在后腸顯著降低。結(jié)合中腸粘液最厚、中腸鯨桿菌屬（Cetobacterium）豐度最高的特點以及以往研究，我們認為鯨桿菌屬具有更好的魚類定植能力，是魚類微生物屏障功能的重要組成部分。以此也說明在評價腸道以及宿主自身健康上粘附菌群不可被忽視以及與內(nèi)容物菌群混為一團，而應(yīng)該被單獨提出來作為健康評估指標。
　　4.將粘附菌群作為一個魚類健康指標，結(jié)

9、合其他腸道健康相關(guān)檢測手段，對水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)在魚類飼料中植物性蛋白替代魚粉后添加植酸酶的效果進行評價。1，000 U/kg飼料植酸酶的添加明顯改善了粘附菌群多樣性:變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和棲熱菌門（Thermus）的相對豐度得到提升;從屬水平來看，梭菌屬（Clostridium sp.）和棲熱菌屬（Thermus sp.）的相對豐度都受到微生物植酸酶的顯著升高調(diào)控。伴隨著的變化是促進了磷

10、的利用率，升高腸道微絨毛密度的同時降低微絨毛長度;腸道應(yīng)激因子Hsp70以及炎癥因子Tnf-α和Tgf-β的水平都被顯著性升高，顯示出由于微生物植酸酶的添加誘導(dǎo)了更高的腸道應(yīng)激和炎癥狀態(tài)。因此本研究認為粘附菌群優(yōu)化，一定程度能夠改善腸道以及宿主福利，但是飲食的直接作用可能會高于菌群優(yōu)化帶來的益處。從本研究可以看出粘附菌群的改變需要得到重視，在評估魚類健康上，可以從一個新的角度進行說明，但是關(guān)于腸道健康與粘附菌群的關(guān)系需要更多的深入研究。