Egr-1特異脫氧核酶對大鼠血管平滑肌細(xì)胞纖維連接蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的: 通過對大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)轉(zhuǎn)染早期生長反應(yīng)因子-1(earlygrowthresponsefactor-1，Egr-1)和Egr-1特異脫氧核酶(DNAenzyme/10-23DRZ，ED5)，檢測轉(zhuǎn)染前后VSMC中Egr-1和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)的變化，研究ED5對大鼠VSMCFN表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)方法: 1、培養(yǎng)大

2、鼠A10主動(dòng)脈VSMC用含10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25％胰酶消化、傳代。 2、分組: 分為三組：空白組、Egr-1轉(zhuǎn)染組、Egr-1+ED5轉(zhuǎn)染組。各組細(xì)胞均用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；Egr-1轉(zhuǎn)染組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Egr-1；Egr-1+ED5轉(zhuǎn)染組對Egr-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ED5。 3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Egr-

3、1當(dāng)VSMC在6孔板內(nèi)達(dá)到60％融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體操作按FuGENE6說明書建議的操作步驟進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入直徑10cm的培養(yǎng)板中并加入含400μg/mlG418的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。2周以后，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆挑入96孔板中并擴(kuò)增。 4、ED5的合成設(shè)計(jì)合成針對Egr-1基因起始密碼AUG的ED5，D5堿基序列為：5’-CCGCTGCCAGGCTAGCTACAACGACCCGGACGT-3’，兩側(cè)下劃線所示部分為寡

4、核苷酸識別序列，中間為保守的催化活性區(qū)，在其3’端和5’端各有兩個(gè)磷酸二酯鍵進(jìn)行硫代硫酸修飾，以增加其穩(wěn)定性。 5、ED5的轉(zhuǎn)染當(dāng)培養(yǎng)的穩(wěn)定高表達(dá)Egr-1的VSMC生長至70％匯合時(shí)，更換無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30h，給予0.1μMED5，進(jìn)行第一次基因轉(zhuǎn)染，18h后更換含10％FBS無抗生素的DMEM進(jìn)行二次轉(zhuǎn)染。 6、實(shí)驗(yàn)檢測方法用RT-PCR檢測培養(yǎng)的VSMC中Egr-1和FNmRNA表達(dá)的變化，用免疫

5、細(xì)胞化學(xué)法檢測Egr-1和FN蛋白表達(dá)的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: RT-PCR法檢測到：空白組VSMC中的Egr-1和FNmRNA弱表達(dá)，Egr-1轉(zhuǎn)染組Egr-1和FNmRNA的表達(dá)明顯增高(p＜0.01)，Egr-1+ED5轉(zhuǎn)染組與Egr-1轉(zhuǎn)染組相比Egr-1和FNmRNA的表達(dá)明顯降低(p<0.01)，與空白組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測到：空白組VSMC中的Egr-1和FN蛋白弱表