MUC5AC粘蛋白和P物質(zhì)在哮喘大鼠肺組織的表達及紅霉素的抗炎機制探討.pdf

1、支氣管哮喘(bronchialasthma，BA)是一類以支氣管及肺部氣道阻塞、氣道高反應性及氣道炎癥為特征的復雜的炎癥性疾病。哮喘的發(fā)病機制復雜，尚未完全清楚。目前普遍的觀點認為哮喘是氣道慢性炎癥。非特異性炎癥抑制劑如皮質(zhì)類固醇激素的廣泛應用提示人們對過敏性氣道炎癥缺乏了解。P物質(zhì)和神經(jīng)激肽A(neurokininA，NKA)是速激肽家族中的調(diào)節(jié)性肽，在正常氣道和支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulm

2、onarydisease，COPD)等慢性氣道疾病中起多方面的作用。由感覺性神經(jīng)末梢釋放的速激肽引的生物學變化包括微血管通透性增加，氣道平滑肌收縮，黏液分泌增加，咳嗽，以及影響白細胞黏附等許多功能，這一系列的效應稱為“氣道神經(jīng)性炎癥”。已證實速激肽誘導的黏液分泌是神經(jīng)依賴性的。而氣道黏液高分泌(mucushypersecretion)和持續(xù)氣道炎癥是多種慢性氣道炎癥性疾病如支氣管炎、支氣管哮喘、COPD和肺囊性纖維化等的共同特征。并且黏

3、膜下腺和氣道上皮充滿炎癥細胞，黏液腺細胞和氣道黏液是這些慢性呼吸道病人的一個共有的癥狀和病理特點。MUC5AC是一種主要的黏蛋白基因，在正常氣道也有表達，但在哮喘和COPD病人的氣道是增加的。雖然氣道黏蛋白分泌是氣道防御的重要組成部分，但過多分泌也是氣道阻塞的重要原因之一，在致死性哮喘病人中，幾乎總是與氣道黏液過多分泌引起的阻塞有關。另外，黏液高分泌是哮喘病人的一個共同癥狀，特別是哮喘加重期。已證明黏液產(chǎn)生與病人的FEV1下降有關。這證

4、明黏液高分泌是哮喘加重的一種標志。由于觀察到小劑量應用紅霉素可有效的治療泛發(fā)性毛細支氣管炎。人們將紅霉素的治療范圍延伸到其它的炎癥性疾病，包括對哮喘，嗜酸性粒細胞增多癥的治療都取得了療效。盡管紅霉素對炎癥性疾病的治療具體機制不明確，初步的研究認為紅霉素有抗炎作用。臨床研究報道長期小劑量紅霉素治療可降低氣道高反應性以及支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)和嗜酸性粒細胞陽離子蛋白濃度。體外研究己證實紅霉素可直接抑制前炎因子的產(chǎn)生，而前炎因子是炎

5、癥中的重要介質(zhì)，提示紅霉素有直接的抗炎特性?；谝陨涎芯浚覀儗⒔⒁粋€SD大鼠哮喘動物模型，希望能回答下面的幾個問題：①紅霉素在氣道過敏性疾病中是否有抗炎作用；②紅霉素是否通過抑制P物質(zhì)(或)和黏蛋白MUC5AC的產(chǎn)生達到抗炎作用；③地塞米松在SD大鼠過敏性氣道炎癥中是否有抗炎作用；④地塞米松是否通過抑制P物質(zhì)(或)和黏蛋白MUC5AC的產(chǎn)生達到抗炎作用；⑤紅霉素和地塞米松通過抑制P物質(zhì)(或)和黏蛋白MUC5AC的產(chǎn)生達到抗炎作用方面

6、是否有不同。 材料及方法 (1)動物的選擇：SD大鼠，雄性，4-6周齡，體重150-200克，所有動物購自鄭州大學實驗動物中心。 (2)動物實驗分組：所有動物隨機分為四組(對照組、模型組、地塞米松治療組、紅霉素治療組)，每組12只。 (3)模型制作：腹腔注射卵清蛋白(OVA)一次致敏模型組動物、地塞米松治療組、紅霉素治療組，同時佐以氫氧化鋁，2周后給予1％OVA霧化吸入，每天一次連續(xù)7天激發(fā)動物。對照組動

7、物用0.9％氯化鈉代替OVA。地塞米松治療組動物霧化吸入1％OVA的前1小時每天一次給予地塞米松(0.5mg/kg)腹腔注射。紅霉素治療組霧化吸入1％OVA的前1小時每天一次給予紅霉素(50mg/kg)腹腔注射。對照組和模型組動物給予同樣體積的0.9％氯化鈉腹腔注射。 (4)支氣管肺泡灌洗：2％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈放血處死大鼠。用0.9％氯化鈉每次3ml，共3次灌洗左肺。灌洗液離心后重懸于1mlPB

8、S，用1-2％冰乙酸溶解紅細胞后進行細胞計數(shù)和瑞氏染色。 (5)肺組織病理分析：將右肺中葉浸入10％甲醛溶液中固定。按常規(guī)制作石蠟切片。HE染色觀察。 (6)P物質(zhì)(SubstanceP)免疫組織化學：按免疫組化常規(guī)進行。用P物質(zhì)抗體染色。 (7)MUC5AC黏蛋白免疫組織化學：按免疫組化常規(guī)進行。用MUC5AC黏蛋白抗體染色。 (8)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)均用(X)士S來表示。組間均數(shù)比較前先進行

9、正態(tài)分布及方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和兩兩比較采用最小顯著差(LSD)檢驗，應用統(tǒng)計軟件SPSS11.0進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。 結果 (1)肺組織病理變化：模型組病理形態(tài)學表現(xiàn)為明顯支氣管收縮征象，支氣管上皮黏液增多。氣道周圍及血管周圍大量淋巴細胞浸潤，伴單核細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。肺泡間質(zhì)淋巴細胞和單核細胞浸潤，也有少量嗜酸性粒細胞。 (2)支氣管肺泡灌洗液(BA

10、LF)中白細胞總數(shù)和分類計數(shù)：模型組動物支氣管肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)(X106/ml)及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和單核/巨噬細胞絕對計數(shù)(X106/ml)(14.5±4.09，0.45±0.02，2.63±1.25，5.55±0.80，6.34±1.38respectively)均較對照組(6.27±0.70，0.10±0.01，1.09±0.60，2.36±1.01，2.64±1.33，respectively)明顯升高，P

11、＜0.01。 (3)P物質(zhì)的表達：與對照組相比，模型組肺內(nèi)支氣管至終末細支氣管可見較多SP陽性纖維分布，此外，在呼吸性細支氣管和肺泡道亦有分布，其分布特點是：密集，呈束狀走行；在平滑肌層增多更為明顯。半定量統(tǒng)計處理結果表明模型組小支氣管層單位面積內(nèi)(2.3333±0.4924)較對照組(0.5000±0.5223)明顯增多，P＜0.01。 (4)MUC5AC黏蛋白的表達：免疫組化結果表明對照組MUC5AC黏蛋白主要表達于

12、氣道上皮，而基底部和肺泡則無表達。特點是：陽性產(chǎn)物呈顆粒狀，定位于細胞漿。肺內(nèi)支氣管至終末細支氣管上皮間稀疏分布，管腔未見黏蛋白陽性產(chǎn)物。呼吸性細支氣管和肺泡道未見陽性產(chǎn)物。模型組肺組織MUC5AC黏蛋白表達于氣道上皮，管腔內(nèi)亦見大量黏蛋白陽性產(chǎn)物。特點是：陽性產(chǎn)物呈粗大顆粒狀，定位于細胞漿。肺內(nèi)支氣管至終末細支氣管上皮間分布密集，呼吸性細支氣管和肺泡道可見陽性產(chǎn)物。半定量處理結果表明模型組MUC5AC黏蛋白的表達(2.4167±0.6

13、685)較對照組(0.58334±0.7929)明顯升高，P＜0.01。 (5)肺組織病理變化：病理切片顯示紅霉素可明顯減輕過敏性氣道炎癥。盡管炎癥反應仍存在，但炎癥細胞浸潤的范圍較模型組明顯減小。紅霉素可明顯減少黏液分泌。 (6)BALF中白細胞總數(shù)和分類計數(shù)：紅霉素治療組BALF中白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴和單核細胞/巨噬細胞絕對計數(shù)(106/ml)(11.39±0.10，0.18±0.02，1.65

14、±0.94，3.61±1.17，4.79±1.94，respectively)較模型組(106/ml)(14.5±4.09，0.45±0.02，2.63±1.25，5.55±0.80，6.34±1.38respectively)降低，P＜0.01。 (7)P物質(zhì)的表達：紅霉素治療組小支氣管層單位面積內(nèi)P物質(zhì)的表達(1.250±0.4523)較模型組(2.3333±0.4924)明顯減少，P＜0.01。 (8)MUC5AC

15、黏蛋白的表達：紅霉素治療組MUC5AC黏蛋白的表達(1.1667±0.9374)較模型組(2.4167±0.6685)明顯降低，P＜0.01。 (9)肺組織病理變化：病理切片顯示地塞米松可明顯減輕過敏氣道炎癥，炎癥細胞浸潤的范圍較模型組明顯減輕。氣道黏液基本消失。 (10)BALF中白細胞總數(shù)和分類計數(shù)：地塞火松干預組BALF中白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴和單核細胞/巨噬細胞絕對計數(shù)(106/ml)(9.7

16、5±1.13，0.15±0.01，1.51±0.62，3.26±1.46，4.38±1.79，respectively)較模型組(106/ml)(14.5±4.09，0.45±0.02，2.63±1.25，5.55±0.80，6.34±1.38respectively)，P＜0.01。 (11)P物質(zhì)的表達：地塞米松治療組小支氣管層單位面積內(nèi)P物質(zhì)的表達(0.7500±0.6216)較模型組(2.3333±0.4924)明顯減少

17、，P＜0.01。 (12)MUC5AC黏蛋白的表達：地塞米松治療組MUC5AC黏蛋白的表達(0.9167±0.6696)較模型(2.4167±0.6685)明顯降低，P＜0.01。 結論 (1)根據(jù)苗會等的方法致敏和激發(fā)SD大鼠后，SD大鼠過敏性氣道炎癥模型成功建立。 (2)P物質(zhì)增加是SD大鼠過敏性氣道炎癥發(fā)病機制之一；MUC5AC黏蛋白表達增加可能參與過敏性氣道炎癥發(fā)病過程。 (3)地塞米松通