潰瘍性結腸炎免疫功能變化及振脾湯干預的基礎與臨床研究.pdf

1、潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種原因不明的慢性非特異性結腸炎癥，病變主要位于結腸的粘膜層和粘膜下層，以炎癥和潰瘍?yōu)橹鳎嘞壤奂爸蹦c和遠端結腸，但可向近端擴展，以至遍及整個結腸。主要癥狀有腹瀉及膿血粘液便、腹痛和里急后重。病程漫長，病情輕重不一，常反復發(fā)作。本病可見于任何年齡，但20～30歲最多見，男稍多于女。本病在歐洲相當常見，患病率約40～100/10萬，發(fā)病率為3～11.5/10萬。國內(nèi)尚未見精確統(tǒng)計

2、報道，但本病的發(fā)病率較國外低，近年來有明顯的增加趨勢。由于UC病程長、病變范圍廣泛者被公認為是結腸癌的癌前病變，目前UC已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一?，F(xiàn)代醫(yī)學對UC的治療雖然不斷推陳出新，但都存在副作用大，易復發(fā)等特點。 近年來越來越多的研究表明免疫功能亢進在UC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。國內(nèi)外已相繼有一些關于細胞因子和T細胞功能的報道，但有關UC與紅細胞免疫功能的研究甚少。本課題根據(jù)UC的發(fā)病特點及治療進展，結合中藥具有免疫

3、調(diào)節(jié)功能、毒副作用少的特點，選取中藥方劑振脾湯從四個方面進行了研究：(1)采用TNBS/乙醇誘導大鼠潰瘍性結腸炎動物模型，從臨床癥狀改變、病理形態(tài)變化探討與人UC的相似程度。(2)研究TNBS/乙醇致UC大鼠的免疫功能的變化，包括T細胞亞群、紅細胞免疫、免疫球蛋白、補體以及炎癥介質(zhì)。(3)選取中藥方劑振脾湯為治療藥物，觀察振脾湯對TNBS/乙醇致UC大鼠的療效和免疫功能變化。(4)振脾湯應用于臨床，觀察治療緩解期UC患者的療效并研究其對

4、免疫功能的影響。為探討UC發(fā)病的免疫病理損傷過程和選擇治療藥物奠定基礎。 第一部分潰瘍性結腸炎動物模型制作 目的：采用TNBS誘導大鼠潰瘍性結腸炎動物模型，探討與人UC的相似程度。 方法：TNBS/乙醇法制作潰瘍性結腸炎動物模型，分別于造模后1周、3周、7周三個時間段動態(tài)觀察模型鼠的一般狀態(tài)、結腸粘膜大體和病理及電鏡變化。 結果 1 一般情況：正常組大鼠大便顆粒狀，肛周潔凈。造模第2天大鼠出現(xiàn)腹瀉

5、，軟便或稀便。2周時癥狀達到高峰，膿血便，大便完全為稀便。癥狀持續(xù)3周時開始逐漸好轉。第4-7周為微軟顆粒狀大便。 2 大體形態(tài)觀察和損傷評分：正常組生理鹽水灌腸僅引起結腸輕微的充血；大鼠模型1組，結腸粘膜充血水腫、糜爛，潰瘍呈白色線狀或灶狀，其大體形態(tài)損傷評分為7.35±1.21；模型2組，結腸粘膜水腫、紅斑、潰瘍，周圍粘膜增厚，其大體形態(tài)損傷評分為4.51±1.08；模型3組結腸大體形態(tài)逐漸恢復正常，潰瘍已愈合，其大體形態(tài)損

6、傷評分為1.27±0.41，與正常對照組相比模型組的大體形態(tài)損傷有顯著差異(p<0.01)，各模型組間亦有明顯差異(P<0.05)。 3 光鏡下觀察病理情況：正常組生理鹽水灌腸僅引起結腸輕微的充血；大鼠模型1組，結腸粘膜上皮水腫、壞死、脫落，以中性粒細胞浸潤為主，組織學損傷計分為8.51±1.07；模型2組，可見瘢痕組織，在潰瘍灶表面仍可見大量炎細胞，組織學損傷計分為6.28±0.87；模型3組表現(xiàn)為慢性炎癥，可見正在愈合的潰瘍

7、，結締組織增生并纖維化，組織學損傷計分為2.47±0.96，與正常對照組相比模型組的組織學損傷有顯著差異(p<0.01)，各模型組間亦有明顯差異(P<0.05)。 4 電鏡結果：1)掃描電鏡：正常組可見結腸粘膜表面大量吸收細胞，其表面有大量微絨毛；模型組可見微絨毛縮短和數(shù)目減少或消失，杯狀細胞減少。2)透射電鏡：正常組結腸粘膜的吸收細胞呈高柱狀，核橢圓形，常染色質(zhì)豐富。模型組可見游離面吸收細胞部分微絨毛減少，細胞核稍不規(guī)則，細胞

8、器數(shù)量減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆粒現(xiàn)象。 結論：三硝基苯磺酸(TNBS)可以成功誘導大鼠潰瘍性結腸炎動物模型，一般情況、大體與病理表現(xiàn)與人UC的相似度高，有急、慢性轉變過程等，而且是免疫學模型，可用于UC免疫學方面的研究。 第二部分潰瘍性結腸炎免疫功能變化的動物實驗研究 目的：研究TNBS/乙醇致UC大鼠的免疫功能的變化，包括T細胞亞群、紅細胞免疫、免疫球蛋白、補體以及炎癥介質(zhì)的變化。 方法 1 采用

9、ELISA檢測uC大鼠細胞因子TNF-α、IL-2、IL-4的變化。 2 采用流式細胞儀檢測UC大鼠T細胞亞群的變化。 3 采用免疫比濁法檢測UC大鼠血清免疫球蛋白和補體的變化。 4 采用酵母菌花環(huán)法檢測UC大鼠紅細胞免疫功能的變化 結果 1 UC大鼠細胞因子的變化：結果表明模型組血清TN-α、IL-2含量在1周、3周、7周三個時間段均有顯著升高，與正常組比較有顯著差異(P<0.05)，1周時表達

10、最高，3周時已有明顯下降，7周時與1周模型組比較有顯著差異(P<0.05)。而血清IL-4含量在1周、7周時UC大鼠與正常組比較無顯著差異(P>0.05)，3周時出現(xiàn)降低，與其它組比較有顯著差異(P<0.05)。 2 UC大鼠T細胞亞群的變化：結果表明造模后1周、3周、7周三個時間段模型組大鼠外周血CD3<'+>、CD4<'+>細胞百分比均明顯高于正常組(P<0.05)；而CD8+細胞百分比較正常組降低(P<0.05)；CD4<

11、'+>/CD8<'+>比值明顯高于正常組(P<0.05)。 3 UC大鼠血清免疫球蛋白和補體的變化：結果表明造模后1周、3周、7周三個時間段模型組大鼠外周血血清免疫球蛋白IgG、IgA均明顯高于正常組(P<0.05)，在造模1周時表達最高，3周時已有下降，7周時與1周模型組比較已有顯著差異(P<0.05)；IgM與正常組比較無顯著差異(P>0.05)；而補體C3、C4在三個時間段均較正常組降低(P<0.05)。 4 UC

12、大鼠紅細胞免疫功能的變化：酵母菌花環(huán)法紅細胞免疫結果表明造模后1周、3周、7周三個時間段模型組RCIC含量均顯著高于正常組(P<0.05)，但其含量在逐漸減少，7周模型鼠已明顯低于1周模型鼠(P<0.05)；而RC3bR在三個時段均降低(P<0.05)，其含量在逐漸升高，7周模型鼠已明顯高于1周模型鼠(P<0.05)。 結論 1 T細胞亞群CD3<'+>、CD4<'+>、CD4<'+>/CD8<'+>增高，CD8<'+>

13、細胞比例下降。 2 細胞因子TNF-α、IL-2含量增高，IL-4含量降低。 3 外周血免疫球蛋白IgG、IgA含量異常增高，補體C3、C4降低。 4 紅細胞免疫示RCIC升高，RC3bR降低。說明存在細胞和體液免疫功能亢進，紅細胞免疫功能障礙，導致循環(huán)免疫復合物(CIC)在腸粘膜的沉積，從而引發(fā)腸粘膜局部的變態(tài)反應。 第三部分振脾湯對潰瘍性結腸炎免疫功能影響的動物實驗研究 目的：選取中藥方劑振脾

14、湯為治療藥物，觀察振脾湯對TNBS/乙醇致UC大鼠的療效并探討其作用機制。 方法 1 觀察各組大鼠的一般狀態(tài)、結腸粘膜大體和病理變化。 2 免疫學檢測指標：(1)ELISA法檢測血清TNF-α、IL-2、IL-4的變化；(2)采用流式細胞儀檢測uc大鼠T細胞亞群的變化)；(3)酵母菌花環(huán)法檢測：RCIC、RC3bR的變化。 結論 1 治療后細胞因子TNF-α、IL-2、IL-4和T細胞亞群CD3<

15、'+>、CD4<'+>、CD8<'+>細胞百分、CD4<'+>/CD8<'+>比值恢復至正常水平，說明被打破的Th1/Th2平衡得到糾正，機體細胞免疫功能亢進的情況得到了有效的抑制。 2 治療后紅細胞免疫結果示RCIC、RC3bR亦恢復至正常水平，也進一步驗證了本中藥對體液免疫功能亢進的糾正能力，組織病理學顯示病變組織被修復，粘膜大體形態(tài)恢復。與UC的經(jīng)典用藥SASP作為對照研究其機理，顯示振脾湯在慢性期對UC的療效優(yōu)于SASP

16、。 第四部分振脾湯對潰瘍性結腸炎緩解期患者的臨床療效觀察 目的：觀察振脾湯治療緩解期UC患者的療效，并研究其對免疫功能的影響。 方法 1 觀察患者的1年內(nèi)復發(fā)情況。 2 結腸鏡主要觀察結腸粘膜的充血、水腫等。 3 結腸鏡粘膜活檢觀察粘膜的炎細胞浸潤、腺體排列異常、杯狀細胞減少等指標。 4 免疫比濁法檢測血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM補體C3、C4。 5 流式檢測T細胞

17、亞群CD<,3><'+>、CD<,4><'+>、CD<,8><'+>百分率、CD<,4><'+>/CD<,8><'+>的變化和CD<,19><'+>、CD<,56><'+>百分率。 6 酵母菌花環(huán)法檢測RCIC、RC3bR的變化。 結論 1 治療后振脾湯組復發(fā)率明顯低于SASP組，說明振脾湯組遠期療效優(yōu)于SASP組。 2 結腸鏡及腸粘膜病理改變證實治療后兩組結腸粘膜病理組織學變化與治療前比較均有不同程度的