沾化冬棗基因工程改良的基礎(chǔ)研究.pdf

1、沾化冬棗(ZiziphusjujubaMill.)是鮮食棗果中的珍品，作為我國特有的晚熟鮮食果品，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)前景。然而，沾化冬棗成熟期集中，貯藏期短，常溫下僅能保存6-7天；利用常規(guī)儲(chǔ)藏方法，果實(shí)出庫后品質(zhì)不佳，貨架期也只有3-5天。因此，如何在保持果實(shí)鮮食品質(zhì)的前提下延長貯藏期，成為果樹遺傳改良中亟待解決的問題之一。冬棗屬于高呼吸強(qiáng)度的非躍變型果實(shí)，ABA對(duì)其后熟及貯期衰老起著非常重要的作用，影響棗果后熟過程中各類酶

2、活性和果實(shí)貯藏物質(zhì)的降解速率及硬度，是導(dǎo)致棗果變軟衰老的啟動(dòng)因素。因此，通過反義基因技術(shù)組織特異性的降低ABA合成強(qiáng)度有可能延長棗果采收期和貯藏保鮮期。然而，有關(guān)沾化冬棗遺傳工程的研究未見報(bào)道。本工作主要研究?jī)?nèi)容有二，一是將ABA合成途徑中關(guān)鍵酶基因重組到植物表達(dá)載體，二是建立沾化冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系，為利用反義基因技術(shù)延長棗果采收期和貯藏保鮮期的工作奠定基礎(chǔ)。 ZEP基因和NCED基因是ABA合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。在第一部分工作

3、中，將本實(shí)驗(yàn)室克隆的來自鹽芥(Thellungiellahalophila)的ZEP基因和NCED基因分別重組到質(zhì)粒pCAMBIA1300-als的KpnI位點(diǎn)，并分別獲得了含有目基因正、反向插入的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-ZEP(+)-als、pCAMBIA1300-ZEP(-)-als、pCAMBiA1300-NCED(+)-als和pCAMBIA1300-NCED(-)-als，并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。用攜帶上

4、述質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了煙草葉盤，在加有選擇劑的培養(yǎng)基上獲得轉(zhuǎn)化植株。對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和Southern雜交鑒定，證明外源基因已整合到煙草基因組。并為鑒定鹽芥ZEP基因和NCED基因的功能準(zhǔn)備了材料。 建立遺傳轉(zhuǎn)化體系是利用基因工程改良作物的基礎(chǔ)，本工作以沾化冬棗組織培養(yǎng)苗莖尖為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA和來自擬南芥的乙酰乳酸脫氫酶突變基因als導(dǎo)入冬棗細(xì)胞，獲得了轉(zhuǎn)化小苗。在此基礎(chǔ)上，研

5、究了農(nóng)桿菌懸浮液濃度、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和真空滲入處理等對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，建立起效率較高的沾化冬棗遺傳轉(zhuǎn)化體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將冬棗莖尖在OD6000.6-0.8的農(nóng)桿菌懸浮液中浸染10-15min，輔以50KPa的負(fù)壓處理，共培養(yǎng)3-4天，可獲得最佳轉(zhuǎn)化頻率(PCR陽性植株數(shù)/篩選前存活莖尖數(shù)×100％)。最佳轉(zhuǎn)化頻率為5.2％。PCR檢測(cè)在植株移栽成活后進(jìn)行，除擴(kuò)增目的基因和標(biāo)記基因外，還根據(jù)植物表達(dá)載體非T-DNA區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)