糖基化磷脂酰肌醇錨定型人B7-1基因重組蛋白錨定腎癌細(xì)胞膜對(duì)提高細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷自身腫瘤作用的研究.pdf

1、腎腺癌(adenocarcinoma of the kidney)又稱腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma RCC)免疫過程主要是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，而T淋巴細(xì)胞的活化需要兩個(gè)信號(hào)系統(tǒng)，第一信號(hào)是由T淋巴細(xì)胞受體(TCR)與抗原肽一MHC復(fù)合物相結(jié)合所提供；第二信號(hào)是由共刺激分子或輔助分子通過與T細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合而傳遞。RCC缺乏共刺激信號(hào)的表達(dá)，使T淋巴細(xì)胞進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)或程序性死亡，出現(xiàn)RCC的免疫逃逸。 B7

2、-1分子是腫瘤免疫過程中重要的共刺激分子之一，它通過與T細(xì)胞表面的CD28受體結(jié)合介導(dǎo)第二信號(hào)，協(xié)同由CTR介導(dǎo)的第一信號(hào)，共刺激T細(xì)胞增殖并產(chǎn)生多種淋巴因子，促進(jìn)并協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)的發(fā)生。RCC細(xì)胞因缺乏共刺激因子的表達(dá)而獲得免疫逃逸，因此將B7-1與糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白融合，利用GPI錨的功能將B7-1靶向錨定在RCC細(xì)胞膜表面，這種B7-1修飾的腫瘤細(xì)胞膜可同時(shí)提供抗原特異性的第一信號(hào)和共刺激信號(hào)，有效激發(fā)CD<,4><

3、'+>，CD<,8><'+>細(xì)胞及NK細(xì)胞的增殖和活化，能抵抗非修飾腫瘤細(xì)胞侵襲，一定條件下能降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。 糖基化磷脂酰肌醇(GPI)蛋白是一種細(xì)胞表面膜蛋白，通過GPI結(jié)構(gòu)錨定于細(xì)胞表面，而不跨越其磷脂雙層結(jié)構(gòu)，亦無細(xì)胞內(nèi)區(qū)。GPI蛋白可以被去污劑由細(xì)胞表面洗脫，以假微團(tuán)的形式存在于溶液中，當(dāng)再次與靶細(xì)胞或細(xì)胞膜共同孵育時(shí)，可自動(dòng)再次錨定于細(xì)胞表面，并恢復(fù)其功能。 本項(xiàng)研究依據(jù)腫瘤免疫過程中共刺激因子B7-1

4、的作用，和GPI錨定信號(hào)的理論和方法，利用分子生物學(xué)手段，將B7-1胞外區(qū)編碼序列同天然GPI蛋白衰變加速因子(DAF)C端編碼的34個(gè)氨基酸的錨定信號(hào)的基因序列重組，將重組基因插入真核表達(dá)載體pCNA3，構(gòu)建表達(dá)載體pCDNA3-GPI-B7-1與質(zhì)粒pSV2-dhfi共轉(zhuǎn)染CHO/DHFR<'->細(xì)胞，使得CHO/DHFR<'->穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白GPI-B7-1，再?gòu)脑揅HO/DHFR<'->上大量洗脫目的蛋白GPI-B7-1，并進(jìn)

5、行分離純化，經(jīng)Western Blot檢測(cè)活性。提純的目的蛋白錨定于原代培養(yǎng)出的RCC細(xì)胞膜上，與自體CTL細(xì)胞混合培養(yǎng)后，分離出該CTL細(xì)胞，檢測(cè)其功能，并殺傷RCC細(xì)胞，觀察CTL的活性，探討GPI-B7-1作為腫瘤疫苗對(duì)于RCC的意義。并進(jìn)一步探討利用GPI錨定蛋白轉(zhuǎn)化法制備腫瘤疫苗在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的應(yīng)用前景。 結(jié)果和結(jié)論如下： 1、通過直接免疫熒光證實(shí)，經(jīng)pCDN-A3-GPI-B7-1和質(zhì)粒pSV2-dhfr

6、共轉(zhuǎn)染CHO/DHFR<'->細(xì)胞，經(jīng)篩選加壓，能夠穩(wěn)定并高效表達(dá)目的蛋白GPI-B7-1。 2、提取并純化GPI-B7-1蛋白，經(jīng)Western Blot檢測(cè)具有免疫活性。 3、通過原代培養(yǎng)建立了一株RCC細(xì)胞系CG-6327，并經(jīng)過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和電鏡檢測(cè)，證實(shí)為RCC細(xì)胞；經(jīng)直接免疫熒光證實(shí)，CG-6327細(xì)胞上不表達(dá)B7-1分子。 4、經(jīng)直接免疫熒光證實(shí)，提取的GPI-B7-1蛋白可以錨定在該RCC細(xì)胞膜

7、上。 5、經(jīng)過GPI-B7-1錨定的該。RCC細(xì)胞膜可以作為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的活化物，使得體外培養(yǎng)的CTL特異性殺傷該RCC的功能增強(qiáng)。 上述結(jié)果表明，通過基因重組方法表達(dá)的GPI-B7-1錨定蛋白，可被轉(zhuǎn)移并錨定在適宜的細(xì)胞膜上，并能恢復(fù)其功能。利用此蛋白轉(zhuǎn)移的方法，使得RCC細(xì)胞膜表面再次出現(xiàn)共刺激信號(hào)，從而提供T細(xì)胞活化所需的雙信號(hào)刺激，提高CTL對(duì)腫瘤的識(shí)別和殺傷能力。該研究為免疫治療提供了一種新的方