電針關元、足三里對衰老模型大鼠T細胞免疫調控機制研究.pdf

1、目的：深入觀察電針關元、足三里對D—半乳糖衰老模型大鼠的神經—內分泌—免疫網絡相關物質的調節(jié)效應，探索針灸調控T細胞免疫延緩衰老的科學方法和作用機制． 方法：立足中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學對于衰老的科學認識，制作D—半乳糖致衰老大鼠80只(雌雄各半)作為衰老模型，隨機分組設衰老模型(Model)組×2、衰老模型電針(EA)組×2、衰老模型免疫抑制(ISU)組、衰老模型電針加免疫抑制(EA+ISu)組、衰老模型米非司酮(RU486)組、衰老模

2、型米非司酮加電針(Ru486+EA)組，每組各10只，另以3月齡大鼠作為正常青年對照(Normal)組10只(雌雄各半)×2。采用電針(HANS，LH202型電針儀，連續(xù)波，頻率2Hz，強度為1mA，通電15分鐘)關元、后三里治療，每日1次，每周日休息1天，共治療27天；采用MTT法檢測T細胞增殖能力，雙抗夾心ELISA法檢測脾臟T細胞誘生IL-2和IL-2R水平，放射免疫法檢測血清IL-6、ACTH，CORT含量，流式細胞術檢測血清C

3、D8+CD28+T細胞表達，免疫組織化學ABC法檢測海馬區(qū)IL-6R、下丘腦β—end和CRH免疫陽性物表達，熒光定量逆轉錄—聚合酶鏈反應(RT—PCR)法檢測海馬和胸腺細胞GRmRNA表達等，分析各組大鼠免疫系統(tǒng)和神經內分泌系統(tǒng)相關指標的變化及聯(lián)系。為探討電針強壯穴的“治未病”效應，借助環(huán)磷酰胺腹腔注射，檢驗電針強壯穴(關元、足三里)對衰老機體的免疫抗病能力影響；另借助糖皮質激素受體拮抗劑米非司酮(RU486)皮下注射，探討海馬對下丘

4、腦—垂體—腎上腺(HPA)軸的負反饋調節(jié)在電針調節(jié)免疫效應中的作用。 結果： 1．Model組T細胞增殖能力、T細胞分泌IL-2及IL-2R水平、T細胞表面抗原CD28表達均明顯低于Normal組(P＜0.01)；電針強壯穴治療后，EA組T細胞增殖及誘生IL-2和IL-2R的水平、T細胞表面抗原CD28的表達均提高(P＜0.01)；電針對衰老模型大鼠T細胞增殖能力的調節(jié)與IL-2及其受體、CD8+CD28+T細胞密度呈正

5、相關； 2．ISU組衰老大鼠經免疫抑制劑腹腔注射后，與Model組比較T細胞增殖指數(shù)、T細胞誘生IL-2、IL-2R分泌、CD8+CD28+T細胞密度明顯降低(P＜0.01，PIL-2＜0.05)；EA+ISU接受電針處置后，上述指標與未電針的ISU組比較卻有顯著性差異(P＜0.01，)與Model組比較未見明顯差異(P＞0.05)； 3．Model組外周血IL-6的分泌和海馬區(qū)IL-6R表達，比Normal組明顯升高(

6、P＜0.01)，電針強壯穴后，在提高衰老模型大鼠T細胞增殖能力同時，能降低外周血IL-6分泌和海馬IL-6R表達水平(P＜0.01)； 4．下丘腦弓狀核β—end免疫組織化學結果，β—end免疫陽性物主要分布在下丘腦弓狀核，高倍鏡下神經元和部分神經膠質細胞胞漿內可見棕褐色陽性顆粒，神經元軸突免疫反應物呈串珠狀。光鏡下Model組神經元胞體數(shù)比Normal組分布少，經電針強壯穴處理的EA組呈現(xiàn)增多趨勢；光密度(OD)值分析表明，與

7、Normal組比較，Model組明顯降低(P＜0.01)；經電針處置后的大鼠EA組與Model組比較，β—end陽性反應物OD值明顯升高(P＜0.05)，與Normal組比較無明顯差異性(P＞0.05)。 5．下丘腦CRH免疫組織化學檢測結果，CRH免疫陽性物主要分布在弓狀核、室旁核，其中室旁核比較明顯，高倍鏡下可見CRH免疫陽性物呈棕褐色，分布于大細胞神經元的胞漿內，經D—半乳糖處理造模的Model組比組胞漿內CRH明顯減少，

8、而經過電針強壯穴處理的EA組胞漿內CRH呈明顯上升趨勢；CRH免疫陽性物OD值分析表明，Model組OD值較Normal組大鼠明顯減少(P＜0.05)，經電針強壯穴治療后的EA組灰度值顯著升高(P＜0.05)，EA組與Normal組之間OD值比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)； 6．與Normal組比較，Model組T細胞增殖能力降低，其血清ACTH和CORT含量卻明顯升高(P＜0.01)，而經實驗處理的EA組ACTH、CORT含

9、量明顯降低，與Model組組間比較有顯著性差異(P＜0.01)；電針對衰老模型大鼠T細胞增殖效應的調節(jié)與電針對HPA軸ACTH、CORT的分泌水平呈負相關，與CRH無明顯相關性； 7．海馬GRmRNA表達完整，未被RNA酶降解；基因擴增產物只有單一峰值，擴增產物具有特異性；目的基因產物片斷長度與設計長度相吻合；與Normal組比較，在Model組T細胞增殖能力降低、血清CORT水平明顯升高同時，海馬GRmRNA表達明顯降低(P＜

10、0.01)；經電針強壯穴處理后，T細胞增殖能力升高、血清CORT水平降低，EA組與Model組比較有顯著性差異(P＜0.01)，海馬GRmRNA表達也明顯升高(P＜0.01)；RU486組海馬GRmRNA表達比Model組明顯降低(P＜0.01，或P＜0.05)；與RU486組比較，EA+RU486組海馬GRmRNA表達有所增加，但組間無顯著性差異(P＞0.05)；EA+RU486組GRmRNA的表達與EA組相比明顯減少(P＜0.01)

11、． 結論： 通過本課題研究，我們認為，電針強壯穴調控T細胞免疫延緩衰老的作用機制是多環(huán)節(jié)、多途徑的： 1、電針強壯穴能通過提高衰老模型大鼠T細胞增殖、T細胞誘生IL-2和IL-2R的水平、CD8+T細胞表面CD28的表達，調節(jié)T細胞免疫功能延緩衰老； 2、電針強壯穴能從T細胞增殖能力、T細胞分泌IL-2和IL-2R的水平以及CD8+T細胞表面抗原CD28表達等方面對抗環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，采用這種以治為

12、防的策略，能增強老年個體免疫防御能力，電針強壯穴延緩衰老具有“治未病”效應； 3、電針強壯穴增強T細胞免疫功能，與電針對神經內分泌系統(tǒng)調節(jié)有關：(1)電針強壯穴能降低外周血IL-6分泌和海馬IL-6R表達，并增加海馬GRmRNA表達，進而增強海馬對HPA軸的負反饋調節(jié)，降低體內高水平ACTH、CORT對T細胞的免疫抑制；(2)電針能提高下丘腦β—end表達，可能與海馬功能恢復，增強對下丘腦β—end的良性調節(jié)、降低β—end向外

13、周過多分泌造成對T細胞免疫功能的抑制效果。同時可能與提高β—end對外周ACTH和GC的負反饋調節(jié)能力有關； 4、RU486能阻斷電針調控海馬對HPA軸的負反饋調節(jié)效應，并影響電針對T細胞免疫增殖的療效，推測海馬GR是實現(xiàn)海馬對HPA的負反饋調節(jié)和對下丘腦良性調節(jié)、繼而對T細胞免疫產生調控作用的重要物質。 綜上所述，我們認為電針強壯穴調控T細胞免疫是通過神經—內分泌—免疫網絡多個環(huán)節(jié)實現(xiàn)的，海馬GR是實現(xiàn)神經內分系統(tǒng)對T

14、細胞免疫產生調控作用的重要物質。血清IL-6，海馬IL-6R，下丘腦β—end以及下丘腦一垂體一腎上腺(HPA)軸上CRH、ACTH和CORT參與了這個網絡的具體調節(jié)過程。 本課題在探討針灸延緩衰老的機制中，從T細胞免疫入手，從神經—內分泌—免疫調節(jié)(NIM)網絡綜合探討針灸調節(jié)免疫延緩衰老的作用機制，為闡明針灸作用機制提供科學的實驗依據，在針灸調節(jié)免疫延緩衰老的同類報道中尚不多見；課題采用提前電針干預衰老模型大鼠，然后對大鼠進