含hTK1和hTIMP1雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:本課題前期研究發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的組織激肽釋放酶1(hTK1)基因過(guò)表達(dá)具有部分抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和改善血管再狹窄的作用,但聯(lián)合基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖是否具有協(xié)同效應(yīng),目前尚不明了。本課題首先構(gòu)建含hTK1和hTIMP1雙基因共表達(dá)的重組腺病毒載體和含基因hTIMP1的重組腺病毒載體,并檢測(cè)病毒滴度。隨后觀察比較雙基因共表達(dá)載體與單基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)后,測(cè)定其感

2、染率以及對(duì)血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響。
　　方法:
　　第一部分:
　　1、由Invitrogen公司購(gòu)買含hTIMP1基因的原始質(zhì)粒,經(jīng)鑒定后,選擇相對(duì)應(yīng)內(nèi)切酶,酶切hTIMP1基因片段和含強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP,經(jīng)連接熱激、轉(zhuǎn)化及構(gòu)建含hTIMP1和EGFP基因的重組穿梭質(zhì)粒,經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序分析進(jìn)行鑒定。
　　2、對(duì)含hTIMP1重

3、組穿梭質(zhì)粒應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BgⅢ/SaⅡ,進(jìn)行酶切并擴(kuò)增、回收含啟動(dòng)子cmv的片段cmv-hTIMP1片斷,選擇對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)同時(shí)酶切質(zhì)粒pDC316-hTK1載體(本研究室保存)并回收,并將上述產(chǎn)物進(jìn)行連接、熱休克法轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH-5ɑ后挑取正確克隆,構(gòu)建含雙啟動(dòng)子和雙基因的重組穿梭質(zhì)粒。經(jīng)PCR、酶切分析和測(cè)序分析進(jìn)行鑒定該質(zhì)粒。
　　3、將上述兩個(gè)重組穿梭質(zhì)粒線性化,并同腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre轉(zhuǎn)染2

4、93A細(xì)胞,在293A細(xì)胞包裝含hTIMP1基因和hTK1和hTIMP1雙基因的重組腺病毒載體,并經(jīng)PCR鑒定毒種中的目的基因;以經(jīng)典TICD50法測(cè)定病毒滴度。
　　第二部分:
　　1、組織塊貼壁法體外培養(yǎng)Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并用Alpha Smooth Muscle Actin單克隆抗體經(jīng)細(xì)胞免疫組化法鑒定正確性。
　　2、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組腺病毒

5、感染率。
　　3、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法分別檢測(cè)細(xì)胞增殖改變。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1、經(jīng)PCR法、雙酶切法和測(cè)序三種方法檢測(cè)證實(shí),含hTIMP1和EGFP的重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hTIMP1-EGFP,和含hTK1和hTIMP1基因的pDC316-cmv-hTK1-cmv-hTIMP1構(gòu)建正確。
　　2、上述兩個(gè)重組穿梭質(zhì)粒分別與骨架質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre在2

6、93A細(xì)胞中成功包裝了含hTIMP1的Ad5-hTIMP1-EGFP重組腺病毒載體,和含hTK1和hTIMP1基因的Ad5-hTK1-hTIMP1重組腺病毒載體,并經(jīng)毒種PCR證實(shí)了目的基因正確性。
　　3、經(jīng)TICD50法測(cè)定兩種重組腺病毒滴度:Ad5-hTIMP1-EGFP為7.0×1011vp/ml,Ad5-hTK1-hTIMP1為8.5×1011vp/ml。
　　第二部分:
　　1、成功原代培養(yǎng)了大鼠VSMCs

7、,細(xì)胞呈梭形、紡錘形,7-10天,細(xì)胞彼此融合,呈束狀排列,部分出現(xiàn)旋窩“峰和谷”樣的生長(zhǎng)模式:經(jīng)細(xì)胞免疫組化鑒定胞漿內(nèi)a-SM免疫熒光陽(yáng)性表達(dá),呈紅色絲狀條紋,說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞是血管平滑肌細(xì)胞,純度達(dá)95％以上,VSMCs純度高。
　　2、Ad5-hTK1-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,感染率呈濃度(20-100MOI)和時(shí)間(1-4d)依賴性增加,在100MOI和第4天時(shí)最高感染率為99.57%;Ad5-hTIMP1-EGFP的感染率同樣

8、呈濃度(20-150MOI)和時(shí)間(1-5d)依賴性增加,在150MOI和第5天時(shí),最高感染率為98.14%。
　　3、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT法結(jié)果顯示:與control組相比,PDGF-BB可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)(P<0.01);對(duì)照病毒組與單純PDGF-BB誘導(dǎo)組的細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異;三種重組腺病毒Ad5-hTK1-EGFP、Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1呈時(shí)間(2-5d)依賴性和感染復(fù)數(shù)(20-1

9、50MOI)依賴性抑制PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs增殖;含雙基因腺病毒載體的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于單基因腺病毒(Ad5-hTK1-EGFP和Ad5-hTIMP1-EGFP)(p<0.01),在第5天150MOI時(shí)的抑制率達(dá)50.97%。
　　結(jié)論:
　　1、本研究通過(guò)雙啟動(dòng)子策略,首次成功構(gòu)建和包裝含hTK1和hTIMP1雙基因的共表達(dá)重組腺病毒載體Ad5-hTK1-hTIMP1,同時(shí)成功構(gòu)建含hTIMP1的重組腺病毒載體Ad5-