沈陽(yáng)地區(qū)健康人群四個(gè)衰老相關(guān)基因的遺傳學(xué)研究.pdf

1、衰老(ageing,senescence)又稱(chēng)老化,通常是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后,隨年齡增加,自身機(jī)能減退,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降,結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性變,趨向死亡,不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。20世紀(jì)后期,在老年學(xué)研究中引入分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)理論與技術(shù)后,研究者們發(fā)現(xiàn),衰老雖然機(jī)理復(fù)雜,涉及面廣,學(xué)說(shuō)雖多,但不外乎遺傳與環(huán)境兩個(gè)方面。位于染色體8p-12上的WRN基因突變所致的隱性遺傳病Wemer早老綜合征(成人型早老癥);同一種

2、屬不同個(gè)體具有不同衰老表型和不同的壽命;家系調(diào)查、雙生子以及流行病學(xué)研究都表明,衰老是一個(gè)高度個(gè)體化的過(guò)程,衰老與遺傳因素密切相關(guān)。
　　 DNA多態(tài)性研究進(jìn)展可分為3階段:限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、微衛(wèi)星多態(tài)性和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)。SNPs相比于前兩代遺傳標(biāo)記其密度高、遺傳穩(wěn)定性好、具有代表性、分布不均勻且其分析易自動(dòng)化。SNPs的變化,尤其是位于編碼區(qū)和位于表達(dá)

3、調(diào)控序列中SNPs的改變,可能引起蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)或量的變化,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平。因而研究SNPs有助于解釋個(gè)體的表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)于衰老和長(zhǎng)壽的易感性差異。怎樣從眾多SNPs中,找到確有臨床意義的與衰老和衰老疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn),是揭示人類(lèi)衰老致病原因的重要途徑之一。
　　 胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin/insulin-like growth factor,insulin/IGF-1)途徑交互作

4、用于許多種蛋白同時(shí)調(diào)控大量的基因表達(dá),Sirt1、IL-6、P16及Klotho四個(gè)基因或者參與insulin/IGF-1信號(hào)途徑,或者和insulin/IGFI-1信號(hào)途徑交互作用從而可能影響衰老的進(jìn)程。IL-6是一個(gè)炎性細(xì)胞因子,其能影響多個(gè)炎性和衰老相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展從而可能最終影響衰老的進(jìn)程;Sirt1是一個(gè)哺乳動(dòng)物NAD+依賴(lài)的脫乙?；?在細(xì)胞周期停滯和DNA修復(fù)中起作用,其能減弱凋亡,調(diào)節(jié)細(xì)胞老化;p16相關(guān)于端?？s短,

5、在細(xì)胞衰老時(shí)其表達(dá)常明顯增強(qiáng);Klotho能影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23信號(hào),p53/p21,cAMP,蛋白激酶C(PKC)和Wnt信號(hào)通路,修復(fù)內(nèi)皮的機(jī)能障礙和調(diào)節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生,從而可能影響衰老的進(jìn)程。
　　 本研究采用候選基因和病例對(duì)照的方法,以中國(guó)沈陽(yáng)地區(qū)漢族健康人群為研究對(duì)象,按照生物學(xué)年齡分組,用Snapshot方法檢測(cè)Sirt1、IL-6、P16及Klotho四個(gè)基因10個(gè)位點(diǎn)的基因型及基因頻率,

6、探討這些基因SNP與衰老的關(guān)系。所獲得的結(jié)果有助于深入闡明衰老的分子遺傳學(xué)機(jī)制,并可為實(shí)現(xiàn)在基因水平上的衰老個(gè)體化評(píng)價(jià),乃至將來(lái)診斷治療病理性衰老奠定重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 本研究采用病例對(duì)照研究,從1500余人中篩選出健康人442人,從反映腦功能、心功能、血管功能、肺功能、腎臟功能和反應(yīng)R常生活狀況的一般指標(biāo)總計(jì)70個(gè)指標(biāo)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法挑選出生物學(xué)標(biāo)志物并構(gòu)建生物學(xué)年齡積分(Biologicalag

7、e score,BAS)計(jì)算公式,將研究對(duì)象按照生物學(xué)年齡分組,分為衰老組228例和年輕組213人。利用生物信息學(xué)方法在四個(gè)候選基因上選擇10個(gè)SNPs遺傳標(biāo)記。利用Snapshot方法檢測(cè)個(gè)體基因型。用擬合優(yōu)度卡方檢驗(yàn)驗(yàn)證每個(gè)SNP基因型在抽樣群體中的分布是否符合H-W(Hardy-Weinberg)平衡,用Genepop3.4軟件檢驗(yàn)H-W平衡。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析每個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因及基因型在年輕組與衰老組之間的分布是否有顯

8、著性差異,從而推測(cè)SNPs位點(diǎn)與衰老的關(guān)系。使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行X2檢驗(yàn)、計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以p＜0.05為顯著性水準(zhǔn)。使用Shesis軟件分析SNPs之間的連鎖不平衡程度、分析同一基因不同位點(diǎn)之間的相互作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、挑選出7個(gè)生物學(xué)標(biāo)志物TMT,CCR,MVES,IMTmin,Dmax,MMEF75/25,PP,并成功構(gòu)建生物學(xué)年齡積分公式,BAS=-0.169(CCR)

9、-0.179(MVES)+0.184(IMTmin)+0.155(Dmax)-0.158(MMEF75/25)+0.226(CA)+0.148(PP)+0.159(TMT)。
　　 2、衰老組和年輕組每個(gè)SNP基因型的H-W平衡檢驗(yàn)都符合H-W遺傳平衡,我們所選擇的研究對(duì)象的基因頻率能夠代表群體的基因分布。
　　 3、IL-6的基因多態(tài)性在健康衰老組和對(duì)照年輕組中頻率分布比較:rs2066992位點(diǎn)兩組間各基因型無(wú)顯著性

10、差異,X2=0.05,P=0.82;等位基因頻率在兩組間無(wú)顯著性差異,X2=0.09,OR=0.95,95％CI:0.70～1.31,P=0.76;rs1524107位點(diǎn)兩組間各基因型無(wú)顯著性差異,X2=0.32,P=0.57;等位基因頻率在兩組間無(wú)顯著性差異,X2=0.20,P=0.66,OR=0.932,95％CI:0.68-1.27。
　　 4、P16基因的基因多態(tài)性在衰老組和年輕組中頻率分布比較:rs2811708位點(diǎn)兩

11、組間各基因型無(wú)顯著性差異,X2=0.28,P=0.59;等位基因頻率在兩組間無(wú)顯著性差異,x2=0.24,P=0.62,OR=0.94,95％CI:0.72-1.22;rs3731245位點(diǎn)兩組間各基因型無(wú)顯著性差異,X2=0.34,P=0.79;等位基因頻率在兩組間無(wú)顯著性差異,X2=0.15,OR=0.94,95％CI=0.70～1.27,P=0.70。
　　 5、Klotho基因的基因多態(tài)性在衰老組和年輕組中頻率分布比較:

12、rs571118位點(diǎn)衰老組CC型頻率高于對(duì)照組,而CT型和TT型頻率低于對(duì)照組,有顯著性差異X2=7.28,P=0.006;T等位基因和C等位基因在兩組間有顯著性差異,X2=6.78,P=0.009,OR=I.424,95％CI:1.09-1.86。Rs1207568位點(diǎn)衰老組CC型,CT型和TT型頻率在衰老組和年輕組比較,差異有顯著性,X2=5.18,P=0.023;等位基因頻率在兩組間比較,也有顯著性差異,X2=5.18,OR=1.

13、31,95％CI=0.78～1.38,P=0.02。Rs2149860位點(diǎn)兩組間各基因型無(wú)顯著性差異,X2=0.30,P=0.58;等位基因頻率在兩組間無(wú)顯著性差異,X2=0.31,OR=1.08,95％CI=0.83～1.40,P=0.58。Klotho基因的rs648202位點(diǎn)兩組間各基因型無(wú)顯著性差異,X2=0.11,P=0.74;等位基因頻率在兩組間無(wú)顯著性差異,X2=0.21,P=0.64,OR=0.93,95％CI:0.69

14、-1.26。
　　 6、Sirt1基因的基因多態(tài)性在衰老組和年輕組中頻率分布,Sirt1基因的rs3758391位點(diǎn)兩組間各基因型無(wú)顯著性差異,X2=0.13,P=0.71;等位基因頻率在兩組間無(wú)顯著性差異,X2=0.71.OR=1.14,95％CI=0.83～2.02,P=0.02。Sirt1基因的rs4746720位點(diǎn)衰老與對(duì)照組的基因型及基因頻率相比較,衰老組CC型頻率低于對(duì)照組差異有顯著意義:X2=3.85,P=0.04

15、;C等位基因頻率低于對(duì)照組,差異有顯著性意義:X2=4.35,OR=1.33,95％CI=1.02～1.73,P=0.03。
　　 7、連鎖不平衡分析結(jié)果Klotho的rs571118,rs2149860,rs1207568,rs648202的四個(gè)位點(diǎn)之間顯示D'＜0.6,rs571118,rs2149860,rs1207568,rs648202四個(gè)位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡。
　　 IL-6的rs2066992,rs15

16、24107之間D'=0.99,rs2066992,rs1524107位點(diǎn)之間強(qiáng)相關(guān)。
　　 P16的rs2811708,rs3731245的之間D'=0.92,rs2811708,rs3731245位點(diǎn)之間強(qiáng)相關(guān)。
　　 Sirt1的rs3758391,rs4746720位點(diǎn)之間進(jìn)行連鎖不平衡及單倍型分析。結(jié)果顯示D'=0.53,rs3758391,rs4746720位點(diǎn)之間不相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　

17、1、成功地構(gòu)建了生物學(xué)年齡積分公式;按照生物學(xué)年齡分組,較傳統(tǒng)時(shí)序年齡更合理地反映個(gè)體的衰老化進(jìn)程。
　　 2、Klotho基因的rs571118的GG基因型和rS1207568位點(diǎn)CC基因型可能為沈陽(yáng)漢族健康人群衰老的危險(xiǎn)因素,其遺傳易感性主要來(lái)自于等位基因G和C。Klotho基因的rs2149860和rs648202的兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性和沈陽(yáng)漢族健康人群的衰老未見(jiàn)相關(guān)。
　　 3、IL-6基因的rs2066992,rS