狹葉番瀉葉相關(guān)基因標(biāo)志及清腸臨床效應(yīng)與番瀉苷A、B含量的關(guān)聯(lián)分析研究.pdf

1、目的： 1、對狹葉番瀉葉蒽酮生物合成代謝途徑關(guān)鍵酶基因苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）基因和查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）基因的部分序列進行測序，尋找基因標(biāo)志生物信息。 2、分析研究對象服用狹葉番瀉葉后的腸道臨床表現(xiàn)，瀉下及副作用，腸液中番瀉苷A、B含量變化，腸粘膜病理形態(tài)，探討PAL和CHS基因標(biāo)志與臨床表現(xiàn)的生物關(guān)聯(lián)性。 方法：

2、 1、設(shè)計PAL和CHS基因引物，對狹葉番瀉葉DNA進行雙向測序，BLAST程序比對測序結(jié)果，并利用DNAStar Megalign軟件與模式植物PAL和CHS基因序列配對分析相似性指數(shù)。 2、觀察HPLC試驗組60例與LC-MS/MS試驗組5例的臨床表現(xiàn)并評分分組，統(tǒng)計分析差異性。兩組腸液樣本分別進行番瀉苷A、B的HPLC分析和番瀉苷B的LC-MS/MS分析，并與臨床表現(xiàn)關(guān)聯(lián)分析。探討基因標(biāo)志與各組腸粘膜病理形態(tài)6項指標(biāo)的關(guān)聯(lián)

3、性。所用統(tǒng)計軟件為SPSS16.0。 結(jié)果： 1、從狹葉番瀉葉獲得三條番瀉苷基因片段，733bp、573bp和262bp，與NCBI的plant結(jié)構(gòu)樹比對呈短相似序列，未發(fā)現(xiàn)NCBI已收錄番瀉PAL和CHS基因相似序列。三條未鑒定基因片段與擬南芥和大豆的PAL和CHS基因相似性指數(shù)在29.7～37.1之間。 2、HPLC試驗組60例分組，無瀉下組1例，輕度瀉下組共25例，中度瀉下組共27例，重度瀉下組共7例。經(jīng)t

4、檢驗比較，副作用總評分在輕度瀉下組與中度瀉下組有顯著性差異（P=0.008，P<0.05）。HPLC分析狹葉番瀉葉樣品和番瀉苷A、B對照品保留時間一致，腸液樣本中未測出番瀉苷。LC-MS/MS試驗組5例分別存在于為輕、中、重度瀉下組，各副作用總評分≥4，由于例數(shù)太少，與臨床瀉下相關(guān)性不明確。LC-MS/MS分析腸液樣本，7/16管腸液樣本出現(xiàn)番瀉苷B吸收峰，都系中、重度瀉下組。 3、依據(jù)該PAL和CHS基因標(biāo)志使用本品番瀉葉，腸

5、粘膜病理形態(tài)在臨床瀉下各組間總體間無顯著性差異（P>0.05），但無充血出血和輕度充血出血程度在輕、中度瀉下組間有顯著性差異（P=0.041，P<0.05）。大多研究對象表現(xiàn)為中度炎癥、輕度充血出血、無水腫（P>.0.05）。 結(jié)論： 1、對狹葉番瀉葉檢出PAL和CHS基因三條未鑒定序列，其與擬南芥的PAL和CHS基因的同源性高于與大豆的相同基因的同源性。發(fā)現(xiàn)該三條序列的微衛(wèi)星重復(fù)特征及生物信息學(xué)特征等基因標(biāo)志，據(jù)此為進

6、一步進行基因與藥效關(guān)聯(lián)分析做了基礎(chǔ)研究。 2、狹葉番瀉輕、中度瀉下組的人數(shù)多于其它組，中度瀉下組的副作用高于輕度瀉下組。清腸狀況良好。HPLC分析番瀉葉及番瀉苷A、B對照品中番瀉苷A、B的保留時間在以誤差為1.5％的范圍內(nèi)一致，HPLC對照組的腸液專屬特異性好，HPLC試驗組腸液中番瀉苷A、B未檢出。LC-MS/MS分析，多次腹瀉者腸液中番瀉苷的含量較高，隨著時間的推移番瀉苷的含量逐漸增大，提示LC-MS/MS法比較可靠的得到試