K-ras基因?qū)Y(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、本研究旨在從細(xì)胞黏附和移動角度探討K-ras對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。 研究目的： 1．在細(xì)胞水平研究K-ras對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響。 2．進(jìn)一步探討K-ras對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)及信號傳導(dǎo)途徑。 ①K-ras 對細(xì)胞黏附的作用：研究 K-ras 對E-cadherin/β-catenin/P120-catenin復(fù)合體的影響②K-ras對細(xì)胞遷移的作用：研究

2、K-ras對RhoA功能的影響③加入P13K/Akt途徑抑制劑和MAPK途徑抑制劑研究K-ras調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的信號傳導(dǎo)途徑。 3．將細(xì)胞水平研究所得結(jié)論應(yīng)用于組織水平，在臨床標(biāo)本中初步探討K-ras突變與β-catenin蛋白及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 材料與方法： 選取人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞，其K-ras基因?yàn)橐吧汀⑼蛔冃蚄-ras質(zhì)粒(prh-K-ras<'Val12>)用脂質(zhì)體Lipofectamine

3、<'TM> 2000轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，同時(shí)選取空質(zhì)粒(prh-GFP)轉(zhuǎn)染作為陰性對照。采用P13K/Akt途徑特異性抑制劑LY294002(50μmol/L)和MAPK途徑特異性抑制劑 PD98059(20μmol/L)抑制相應(yīng)信號通路。采用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察K-ras基因轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌 Caco-2細(xì)胞遷移能力的影響；免疫熒光染色和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測 K-ras基因轉(zhuǎn)染對Caco-2細(xì)胞膜上E-cadherin/β-caten

4、in/P120-catenin復(fù)合體各組分的影響；Pull-Down實(shí)驗(yàn)檢測K-ras基因轉(zhuǎn)染后RhoA蛋白活性的改變；選取31例結(jié)腸腺癌手術(shù)標(biāo)本，PCR-測序方法檢測 K-ras突變情況，免疫組化檢測β-catenin蛋白的表達(dá)變化，同時(shí)了解患者術(shù)后一年內(nèi)有無轉(zhuǎn)移，分析K-ras突變與轉(zhuǎn)移及E-cadherin、β-catenin表達(dá)的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．Transwell實(shí)驗(yàn)，K-ras基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移率為19

5、.8±5.6％，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組遷移率14.0±4.2％比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.000，P<0.05)，K-ras基因轉(zhuǎn)染后加入P13K/Akt途徑抑制劑(LY294002)組為17.5±2.8％，加入MAPK途徑抑制劑(PD98059)組為15.8±1.2％。 2．免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)定位于Caco-2細(xì)胞膜的E-cadhefin、β-catenin蛋白在K-ras轉(zhuǎn)染后減少；免疫沉淀證明K-ras轉(zhuǎn)染后Caco-2細(xì)胞中與E-c

6、adhefin結(jié)合的β-catenin蛋白的量減少；這一下調(diào)作用可被P13K/Akt途徑抑制劑抑制LY294002所抑制，而不被MAPK途徑抑制劑PD98059抑制； Western-Blot檢測到K-ras轉(zhuǎn)染后Caco-2細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)量無明顯改變，但P120-catenin蛋白量減少，但免疫沉淀未檢測到P120-catenin蛋白。 3．蛋白功能Pull-Down實(shí)驗(yàn)證明K-ras轉(zhuǎn)染后RhoA活性明顯

7、增強(qiáng)，這一作用不被P13K/Akt途徑或MAPK途徑抑制劑抑制。 4．31例結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本組織中PCR擴(kuò)增檢測K-ras第一外顯子突變率46.2％1有14例可觀察到β-catenin染色與正常粘膜比胞膜表達(dá)下降、胞漿表達(dá)增加，陽性率為48.3％；其中5例為術(shù)后一年內(nèi)即發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移者，有轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中K-ras突變率為60％(3/5)，無轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中K-ras突變率為42.8％(9/21)；有轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中β-catenin胞膜表達(dá)下降陽

8、性率為60％(3/5)，無轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中β-catenin陽性率為45.8％(11/24)。 結(jié)論： 1．K-ras基因可以促進(jìn)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞的遷移。 2．這一作用是通過減少細(xì)胞膜上的黏附復(fù)合體E-cadherin/β-catenin/P120-catenin和增加細(xì)胞內(nèi)RhoA的活性實(shí)現(xiàn)的，這一作用可部分通過P13K/Akt途徑介導(dǎo)。 3．在臨床標(biāo)本中，K-ras突變有增加結(jié)腸癌術(shù)后第一年腫瘤轉(zhuǎn)移