棉花Cu-Zn-SOD基因的克隆與表達的初步研究.pdf

1、本文初步研究了棉花Cu/Zn-SOD基因的克隆與表達。 (1)以短季棉早熟不早衰品種中棉所36真葉為材料，對其進行傷誘導和高溫處理，然后提取總RNA，得到cDNA，以處理葉片的cDNA為模板，利用RACE技術，克隆了在棉花SOD酶活中占比例最大的Cu/ZnSOD基因(約占86％)，該基因包括兩個：葉綠體Cu/ZnSOD基因和胞質Cu/ZnSOD基因。其中葉綠體Cu/ZnSOD基因的注冊號為DQ120514，基因序列長度1043b

2、p，包含一個645bp的開放閱讀框，起始于98位終止于745位，編碼215個氨基酸。在棉花基因中是兩個拷貝，棉花葉綠體Cu/ZnSOD蛋白與其它植物的葉綠體Cu/ZnSOD蛋白的氨基酸同源性為65.7％～81％。棉花葉綠體Cu/ZnSOD蛋白質的分子量為25.0KD,等電點為6.11。該蛋白質具有兩個酶活性中心，位于葉綠體的基質中，是個球蛋白。胞質Cu/ZnSOD基因的注冊號為DQ445093，基因序列長度682bp,包含一個456bp

3、的開放閱讀框，起始于120位終止于578位，編碼152個氨基酸。在棉花基因中是一個拷貝，棉花胞質Cu/ZnSOD蛋白與其它植物的胞質Cu/ZnSOD蛋白的氨基酸同源性為81％～87％。棉花葉綠體Cu/ZnSOD蛋白質的分子量為15.03KD，等電點為6.09。該蛋白質具有兩個酶活性中心，位于細胞質中，是個球蛋白。 (2)基因表達分析表明：葉綠體Cu/ZnSOD基因在幼嫩的莖、花中有微量的表達，在葉片中高效表達；在中棉所36的苗期

4、、始花期、盛花期、鈴期和吐絮期分別采真葉提取RNA檢測葉綠體Cu/ZnSOD基因的表達結果顯示：基因在苗期表達較低，到初花期到達最高，然后表達量下降。 胞質Cu/ZnSOD基因表達活性在根中最高，其次為葉片，下胚軸，花和莖的表達較弱。說明胞質Cu/ZnSOD基因主要在根和葉片中表達；在整個棉花生育期中呈現(xiàn)有規(guī)律的動態(tài)變化，從苗期開始基因表達逐漸增強，到盛花期達到頂峰，以后逐漸下降;但是從整個生育期觀察，后期的活性比前期高。

5、 (3)棉花葉綠體Cu/ZnSOD基因的原核表達檢測：在基因的起始密碼子和終止子處設計一對引物，以cDNA為模板擴增得到完整的基因全長，然后，構建中間重組子pUC-1-SOD；再構建原核表達載體pET-Cu/Zn-SOD，IPTG誘導表達結果顯示轉化菌株比對照組SOD酶活增高17％，顯示表達產物具有SOD酶的活性。 (4)棉花葉綠體Cu/ZnSOD基因的植物轉化載體的構建：在基因的起始密碼子和終止子處設計一對引物，以cDNA為