熱處理和化學(xué)處理對梨離體植株中病毒的影響.pdf

1、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）和蘋果褪綠葉斑病毒（Applechlorotic leaf spot virus，ACLSV）是梨樹上兩種重要病毒，廣泛分布于世界各梨、蘋果種植區(qū)。在梨樹上這兩種病毒通常不產(chǎn)生明顯的癥狀，但影響樹勢和降低產(chǎn)量。栽培無病毒種苗是減輕這些病毒危害的重要途徑，熱處理和化學(xué)處理是獲得無病毒果樹種質(zhì)的重要途徑。為探索適合這兩種病毒的脫病毒處理條件，建立更加有效的脫病毒技

2、術(shù)，本研究以砂梨離體植株為研究體系，對熱處理和化學(xué)處理進(jìn)程中ASGV和ACLSV在離體植株及其莖尖的分布動態(tài)變化進(jìn)行了研究，取得如下進(jìn)展。 1．采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，對砂梨‘黃花’的20個芽系的ASGV和ACLSV，篩選出帶有這兩種病毒的芽系共13個，通過在MS培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，建立了用于本研究的離體培養(yǎng)體系。 2．采用組織免疫印跡技術(shù)對ASGV和ACLSV在‘黃花’離體植株莖干各部位分布

3、特點進(jìn)行了分析，通過改進(jìn)病毒抗體吸附方法和延長洗滌時間有效降低了非特異反應(yīng)，根據(jù)最終產(chǎn)生紫色反應(yīng)可以判斷病毒存在部位。采用該方法對植株縱切面印跡分析的結(jié)果表明，ASGV和ACLSV在‘黃花’離體植株莖干的頂端和基部含量均很高，莖干中部也有病毒分布，但反應(yīng)顏色相對較淺。 3．合成了這兩種病毒的特異性生物素標(biāo)記探針，建立了病毒斑點雜交和組織印跡原位雜交技術(shù)。采用組織印跡原位雜交技術(shù)對‘黃化’離體植株莖干縱切面和各部位的橫切面印跡進(jìn)行

4、了病毒檢測，其結(jié)果與組織免疫印跡相似，但特異性更強，雜交后免疫檢測產(chǎn)生的紫色反應(yīng)更明顯。 4．采用恒溫（37℃）和變溫（32℃／39℃，8h／16h交替）熱處理技術(shù)對‘黃化’離體植株進(jìn)行了脫病毒處理，采用以上建立的免疫印跡和組織印跡原位雜交技術(shù)對處理不同時間進(jìn)程中植株莖干病毒濃度變化進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在熱處理過程中植株莖干病毒含量隨處理時間的延長而逐漸降低，且莖干頂端病毒濃度的變化較基部更大，恒溫處理至35d或變溫處理至50

5、d后，莖尖基本無病毒產(chǎn)生的特異性紫色反應(yīng)，而這種紫色反應(yīng)在基部仍清晰可見。在處理不同時期，取1～5mm莖尖（37℃）或0.5～5mm（32℃／39℃）莖尖進(jìn)行了再培養(yǎng)，采用ELISA對再生植株病毒檢測的結(jié)果顯示，所取莖尖越小或處理時間愈長，ELISA檢測吸光值愈低，表明隨著處理時間的延長，病毒含量自莖尖向基部逐漸降低，這種變化趨勢與組織印跡觀察到的現(xiàn)象一致。ELISA和斑點雜交的結(jié)果表明，恒溫處理35d后取1mm莖尖或變溫處理45d后取

6、0.5mm莖尖可以脫除ASGV和ACLSV。 5．比較熱處理再生植株的ELISA和斑點雜交檢測結(jié)果顯示，對未處理植株采用ELISA法可以有效檢測這兩種病毒，而經(jīng)熱處理后，植株體內(nèi)病毒含量降低，此時需采用更靈敏的斑點雜交技術(shù)以確保獲得無病毒種質(zhì)。 6．采用組織印跡原位雜交技術(shù)，對病毒醚處理離體植株莖干病毒含量變化進(jìn)行初步分析的結(jié)果表明，經(jīng)病毒醚處理后，植株體內(nèi)病毒含量隨處理時間的延長而逐漸降低，處理至40d后莖尖病毒濃度明