荔枝核、莨芀花和羅浮粗葉木抗鴨乙肝病毒及護肝作用的實驗性研究.pdf

1、為探討中草藥治療乙型肝炎的新方法，我們用自己建立的廣西麻鴨乙肝感染模型，對荔枝核、茛芀花和羅浮粗葉三種中藥材的抗病毒及護肝作用進行了評價。結果發(fā)現(xiàn)，高劑量荔枝核水提物能明顯抑制鴨乙型肝炎病毒的復制，而荔枝核醇提物和低劑量荔枝核水提物沒有明顯抑制鴨乙型肝炎病毒的作用;荔枝核水提物和醇提物降低AST和ALT活性均不明顯。茛芀花醇提取物和羅浮粗葉木提取物均未見有抑制鴨乙肝病毒復制的作用。高劑量茛芀花醇提物對鴨乙肝病毒引起的肝損傷具有一定的保護

2、作用。羅浮粗葉木提取物對鴨乙肝病毒引起的肝損傷保護作用不明顯。
　　第一部分荔枝核抗鴨乙肝病毒及護肝作用的實驗性研究
　　目的:乙型肝炎是我國最常見的傳染病之一，嚴重危害人民的生命和健康。荔枝是廣西最常見的水果之一，本研究擬探討荔枝核提取物對鴨乙型肝炎病毒的療效，評價其將來作為治療人乙型肝炎的可能性。
　　方法:
　　1、用蒸餾水和95％乙醇提取物對荔枝核分別進行水提和醇提。2、建立鴨乙型肝炎病毒DNA熒光定量P

3、CR檢測方法，并評估檢測值和鴨乙型肝炎病毒DNA的敏感性，特異性，重復性，線性度和線性范圍。3、鴨子乙肝動物模型的建立:將乙型肝炎病毒DNA陽性血清0.15毫升注入每只1日齡雛鴨的腹腔。采用分層隨機抽樣方法，將人工感染乙型肝炎病毒的動物隨機分配到六組。五個治療組分別給予高劑量(1.4g/kg)荔枝水提取物，低劑量荔枝核水提取物(0.35g/kg)，高劑量的荔枝核醇提取物（0.7克/千克·天），低劑量荔枝核乙醇提取物（0.18g/kg日）

4、和陽性對照藥物阿昔洛韋(ACV)，模型對照組（給蒸餾水）。觀察治療前和治療后5天，10天及停藥后4天實驗動物血清中乙型肝炎病毒的DNA，ALT和AST水平的動態(tài)變化，并最終進行動物肝臟病理檢查。對DHBV DNA和ALT和AST的測試數(shù)據(jù)，使用使用重復測量資料方差法分析法，而用于判斷肝臟疾病嚴重程度的數(shù)據(jù)，則應用列聯(lián)表卡方檢驗進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)處理和分析使用Windows統(tǒng)計軟件SPSS11.5軟件。
　　結果:
　　1、熒

5、光定量PCR檢測乙型肝炎病毒DNA的方法，該方法具有敏感性好，特異性高，重復性好，線性范圍廣泛的優(yōu)勢。檢測下限在6.93×103至6.93×102拷貝之間;
　　2、雛鴨感染HBV后14天內(nèi)，乙型肝炎病毒DNA顯示隨著時間的推移呈下降趨勢。阿昔洛韋組和高劑量的荔枝水提取物組，相比模型對照組，治療后乙型肝炎病毒DNA的水平明顯下降，表明ACV和高劑量的荔枝核水提取物能抑制乙型肝炎病毒復制，其余治療組與對照組無顯著性差異。高劑量的荔枝

6、核水提取物，其抑制病毒效果和ACV類似，但阿昔洛韋治療組在停藥四天后病毒載量大幅反彈，而高劑量的荔枝核水提物組反彈并不明顯。
　　3、經(jīng)過治療，高劑量水提取物組ALT活性水平比對照組動物低，但由于整個觀察期間的六組動物的的ALT均在正常范圍內(nèi)。因此，不能認為是高劑量的荔枝核水提取物能顯著降低ALT活性。其余治療組和模型對照組比較，ALT活性變化趨勢差異不顯著。6組動物的AST活性也基本上在正常范圍內(nèi)，并且AST的變化在各組差異不顯

7、著，因此也基本可以認為藥物降低AST活性不明顯。
　　4、肝臟病理檢查發(fā)現(xiàn)，在六組動物肝臟疾病的嚴重程度無顯著性差異。表明荔枝核提取物可能沒有保護肝組織的作用。
　　結論:
　　高劑量的荔枝水提取物能顯著抑制鴨乙型肝炎病毒，而荔枝醇提取物（不管是高劑量還是低劑量）及低劑量荔枝水提取物沒有顯著抑制鴨乙型肝炎病毒的作用;未能證實荔枝核水提取物和乙醇提取物可降低ALT和AST水平，病理學檢查也未發(fā)現(xiàn)荔枝核的護肝功能。

8、　　第二部分茛芀花抗鴨乙肝病毒作用的實驗性研究
　　目的:茛芀花是一種非常重要的藥用紅樹植物，在中國民間當中常將搗碎的茛艿花根與蜂蜜混合后服用，以便對乙型肝炎進行治療。但有關茛芀花的確切臨床療效如何尚未有科學評價，其抗乙肝病毒效果也未見的有相關的實驗研究報道。本研究旨在用自己建立的鴨乙肝動物模型來評價茛芀花的抗病毒作用和護肝效果。
　　方法:(1)茛芀花乙醇提取物制備:用70％的乙醇浸泡茛芀花。Bliss法測定急性毒性，計算

9、LD50。(2)觀察茛芀花乙醇提取物的抗鴨子乙型肝炎病毒的作用:經(jīng)過強陽性鴨子乙型肝炎病毒DNA血清0.2毫升在腹腔注射1日齡雛鴨，15天后篩選出DHBV陽性鴨（用FQ-PCR檢測方法），建立人工鴨乙型肝炎病毒感染動物模型。采用分層隨機抽樣方法，將人工感染乙型肝炎病毒的動物，隨機分成五組。四個治療組分別給予茛芀花高劑量乙醇提取物(2.0g/kg)，茛芀花中劑量組乙醇提取物(1.0g/kg)，茛芀花低劑量乙醇提取物（0.5克/千克·天）和

10、陽性對照藥物阿昔洛韋(ACV)治療，另外設一組模型對照組（不給藥物，給蒸餾水）和一個正常對照組（PCR檢測乙型肝炎病毒陰性鴨作為正常對照組，灌服雙蒸水）。每組12只動物，各組雛鴨灌服藥物14天。于治療前(T0)和治療后7天(T7)，治療后14天(T14)，停藥后5天(P5)收集血液樣本，用FQ-PCR法檢測血清中鴨乙型肝炎病毒DNA含量，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清DHBsAg，DHBeAg0D值，同時檢測血清轉氨酶(ALT，AST)，停藥后

11、處死動物，做肝臟病理檢查。(3)數(shù)據(jù)分析:鴨乙型肝炎病毒DNA，DHBsAg和DHBeAg，ALT和AST數(shù)據(jù)采用重復測量的方差方法分析，藥物對鴨肝臟病理的保護效果選用次和經(jīng)驗分析。數(shù)據(jù)處理和分析采用SPSS13.0和PEM3.1統(tǒng)計軟件。
　　結果:
　　1.急性毒性實驗結果表明，茛芀花對小鼠的LD50為20.04g/kg。95％可信區(qū)間17.66～22.74g/kg，表明茛芀花乙醇提取物處于一種無毒的級別。
　　2

12、.茛芀花乙醇提取物對鴨乙型肝炎病毒(DHBV)的抑制作用:
　　(1)治療后，血清鴨乙型肝炎病毒DNA水平僅ACV組比模型對照組顯著降低(P＜0.01)，茛芀花的的三個劑量組與模型組均無顯著性差異，表明茛芀花乙醇提取物沒有直接抑制乙型肝炎病毒的作用。
　　(2)治療后，治療組與模型組相比，血清DHBsAg，在DHBeAg OD值差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。茛芀花乙醇提取物沒有降低血清DHBsAg和DHBeAg活性的作

13、用。
　　(3)治療后，在降低ALT活性的功能方面，阿昔洛韋、中劑量和高劑量組的茛芀花乙醇提取物，比模型對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);還發(fā)現(xiàn)，在降低AST方面，阿昔洛韋和茛芀花高劑量醇提取物較模型對照組功能要強(P＜0.01)。這些結果表明，ACV和茛芀花的乙醇提取物能降低血清ALT，AST水平，改善肝功能，這些功能的大小和茛芀花酒精提取物劑量及用藥時間長短有關。
　　(4)肝臟病理檢查發(fā)現(xiàn)，高劑量組的茛艿花提取物

14、和阿昔洛韋對乙型肝炎病毒引起的肝損傷的有明顯的保護作用(P＜0.01);其余治療組與模型組比較，無顯著性差異。
　　結論:
　　(1)提取的茛芀花酒精提取物的LD50為20.04g/kg，處于無毒級。
　　(2)茛芀花乙醇提取物對鴨乙型肝炎病毒引起肝功能損害具有明顯的保肝作用，作用大小具有劑量相關性。沒有發(fā)現(xiàn)茛芀花乙醇提取物有抑制乙型肝炎病毒的作用。
　　第三部分羅浮粗葉木抗鴨乙肝病毒及其護肝作用的實驗性研究

15、r>　　目的:
　　羅浮粗葉木在福建、廣東等民間被廣泛用于治療病毒性肝炎的治療，但其治療效果如何，沒有嚴格科學意義上的臨床評價，也沒有這種藥材的動物實驗治療效果評價。因此，本研究旨在利用我們自己建立的廣西麻鴨乙型肝炎病毒感染模型，對羅浮粗葉木醇提取物治療效果包括抗病毒效果和護肝效果兩個方面進行評價。
　　方法:
　　羅浮粗葉木醇提物的制備:用70％乙醇提取。急性毒性試驗:為了計算動物實驗所需要的藥物劑量，我們采用改良孫

16、氏寇氏法測定毒性并計算半數(shù)致死量LD50。病毒接種及治療觀察:用0.2m1DHBV DNA強陽性血清，注射至剛孵化1日的雛鴨腹腔，15天后采血用熒光定量PCR篩選出DHBV強陽性鴨子，建立人工感染鴨HBV的動物模型。將人工感染DHBV的雛鴨隨機分配到5個組。其中4個組給予治療分別是高劑醇提物組（2.86g/kg·日）、中劑量醇提物組（1.43g/kg·日）、低劑量醇提物組（0.72g/kg·日）和陽性對照藥物阿昔洛韋(ACV)治療組，另

17、設1組模型對照，以雙蒸水代替藥物。再另設1組正常動物組(DHBV陰性)，也給予等量的雙蒸水。每組12只動物，各組雛鴨均灌胃14天。于灌藥前(T0)、灌藥后7天(T7)、灌藥后14天(T14)、停藥后5天(P5)分別采血，采用熒光定量PCR方法檢測血清中DHBV DNA的載量，用ELISA法測定DHBsAg的0D值，同時檢測血清中的轉氨酶(AST，ALT)，最后處死動物，做肝臟病理學檢查。數(shù)據(jù)分析:采用重復測量資料方差分析方法，分析DHB

18、VDNA、DHBsAg、 ALT與AST的有關檢測數(shù)據(jù)，藥物對鴨肝病理影響的數(shù)據(jù)，則采用秩和檢驗進行分析。數(shù)據(jù)處理分析均采用SPSS13.0 forwindows統(tǒng)計軟件。
　　結果:
　　研究過程中僅ACV組的病毒載量低于模型組（P=0.043），提示ACV能抑制DHBV的復制，但從14天開始到停藥5天，DHBV載量出現(xiàn)反跳。比較各治療組與模型組病毒載量，發(fā)現(xiàn)它們隨時間變化的趨勢都比較相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）

19、，羅浮粗葉木醇提物高、中、低三個劑量的治療組，都未顯示出明顯的抑制DHBV的作用。本實驗中1.2kg羅浮粗葉木生藥制得醇提物3029，經(jīng)口急性毒性實驗發(fā)現(xiàn)其對小鼠的LD50為22.91g/kg，95％可信區(qū)間處于21.41～24.51g/kg之間（孫氏改良寇氏法），屬于無毒級。觀察期內(nèi)，正常動物組的鴨乙肝表面抗原OD值明顯低于治療組及模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;各治療組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明本

20、實驗中羅浮粗葉木醇提物的三個劑量組，都沒有抑制鴨乙肝表面抗原表達的作用。觀察期內(nèi)，各個時點治療組及模型組的ALT和AST數(shù)值均明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各治療組與模型組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示羅浮粗葉木醇提物的高中低三個劑量，都沒有降低ALT、AST水平以及改善肝功能的作用。肝臟病理檢查發(fā)現(xiàn)，三個劑量醇提物治療組的肝組織病變并沒有明顯改善（比較模型組，P＞0.05），提示羅浮粗葉木沒有保護作