肝癌干細胞生物學特征及個體化化療應用研究.pdf

1、背景： 原發(fā)性肝癌手術(shù)機會少，術(shù)后復發(fā)率高，綜合治療在肝癌中具有非常重要的地位?；熥鳛榫C合治療的主要手段之一，對實體瘤有效率仍維持在20～50％，對實體瘤臨床治愈的貢獻僅為5％。而肝癌化療效率低下的特點則相對其他實體瘤更加突出。 腫瘤的個體差異，以及化療中腫瘤細胞生物學特征的改變，是化療失敗的重要原因。近來不少專家提出腫瘤化療應該是規(guī)范下的個體化化療。事實上，在實體瘤中，患者的年齡、表面受體表達情況以及腫瘤病理類型等不

2、同，治療的選擇也有所差異，已經(jīng)開始個體化化療的雛形，并且取得了一定的效果。但是，大多數(shù)實體瘤的個體化化療，特別是肝癌，進展相當緩慢。 腫瘤干細胞的研究是近年來實體腫瘤研究的重要成果，并對實體瘤認識產(chǎn)生了重大影響。研究發(fā)現(xiàn)，只要存在腫瘤干細胞，腫瘤就難以治愈。因而，如果建立針對腫瘤干細胞的個體化化療方案，殺傷腫瘤干細胞，對于實現(xiàn)肝癌的個體化化療有重要的研究價值。 本項研究先探討持續(xù)化療下，肝癌細胞生物學特征改變情況，了解個

3、體化化療的必要性。利用腫瘤干細胞與成體干細胞的關系，根據(jù)卵圓細胞表面標記，研究肝癌細胞不同亞群的成瘤能力，尋找肝癌干細胞樣細胞，并且研究其生組間均無相關性。(2)應用不同藥物刺激HEPG2細胞6個周期，對MRP抗體表達總量進行相關性分析：ADM組與5-FU組，相關系數(shù)r=-0.208，P=0.693；ADM組與DDP組，相關系數(shù)r=0.094，P=0.860；ADM組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=-0.168，P=0.751；5-FU組與DDP

4、組，相關系數(shù)r=0.786，P=0.064；5-FU組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=0.553，P=0.255；DDP組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=-0.645，P=0.167。組間均無相關性。(3)應用不同藥物刺激HEPG2細胞6個周期，對LRP抗體表達總量進行相關性分析：ADM組與5-FU組，相關系數(shù)r=-0.370，P=0.470；ADM組與DDP組，相關系數(shù)r=0.396，P=0.437；ADM組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=-0.387，P=0.4

5、49；5-FU組與DDP組，相關系數(shù)r=-0.029，P=0.957；5-FU組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=0.975，P=0.001；DDP組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=-0.166，P=0.754。除了5-FU組與聯(lián)合組之間有正相關性，并且相關有統(tǒng)計學意義外，其他組間均無相關性。(4)應用不同藥物刺激HEPG2細胞6個周期，對erbB-2抗體表達總量進行相關性分析：ADM組與5-FU組，相關系數(shù)r=0.920，P=0.009；ADM組與DDP組

6、，相關系數(shù)F0.128，P=0.809；ADM組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=-0.402，P=0.430；5-FU組與DDP組，相關系數(shù)r=0.020，P=0.970；5-FU組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=-0.246，P=0.639；DDP組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=-0.644，P=0.151。除ADM組與5-FU組有正相關性外，其他組間無相關性。(5)應用不同藥物刺激HEPG2細胞6個周期，對c-myc蛋白表達總量進行相關性分析：ADM組與5-F

7、U組，相關系數(shù)r=-0.262，P=0.616；ADM組與DDP組，相關系數(shù)r=0.600，P=0.208；ADM組與聯(lián)合組，相關系數(shù)F0.151，P=0.775；5-FU組與DDP組，相關系數(shù)r=-0.725，P=0.103；5-FU組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=-0.018，P=0.972；DDP組與聯(lián)合組，相關系數(shù)r=0.391，P=0.443。組間均無相關性。結(jié)論：不同化療藥物持續(xù)刺激下，肝癌細胞耐藥與增殖等生物學特征變化不同。提示在

8、臨床化療中，個體化治療不可忽視。 對應細胞亞群分別為46.6±3.3％(G1)，26.6±1.8％(S)與26.8±3.5％(G2M)，比較t值與P值分別為：t=8.544，P＜0.001；t=7.341，P＜0.001；t=4.259，P=0.004。亞群間各周期均有顯著性差異。CK7陰性細胞細胞周期分布為63.2±4.2％(G1)，20.2±1.9％(S)與16.6±4.7％(G2M)，對應細胞亞群細胞分別為46.7±4.0

9、％(G1)，28.4±3.3％(S)與25.0±6.3％(G2M)，亞群之間比較，t值與P值分別為：t=10.352，P＜0.001；t=6.308，P＜0.001；t=3.324，P=0.013，亞群間各周期均有顯著性差異。(5)強成瘤能力亞群按照免疫分選方法連續(xù)純化5次(5個純化周期)，Thy-1(+)細胞特征表面標記表達率分別為：23.8±4.5，27.1±3.8，29.7±2.9，28.6±2.2與29.4±2.6。CK7(-)

10、特征表面標記表達率分別為：23.8±4.5，27.1±3.8，29.7±2.9，28.6±2.2與29.4±2.6。配伍組方差分析發(fā)現(xiàn)，不同來源大鼠得到的Thy-1陽性細胞與CK7陰性細胞，特征表面標記表達率差異顯著，Thy-1(+)：F=5.351，P=0.001，CK7(-)：F=3.515，P=0.008。強致瘤能力亞群純化周期不同，特征表面標記表達率差異也顯著，Thy-1(+)：F=7.994，P＜0.001。SNK法進一步兩兩

11、比較發(fā)現(xiàn)，純化周期一與其他4個周期，以及周期二與周期三均有顯著性差異(P＜0.05)，其他周期間無顯著性差異(P＞0.05)。CK7(-)：F=9.147，P＜0.001。SNK法進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，周期一與其他4個周期有顯著性差異(P＜0.05)，但是其他周期間無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論：(1)CK7(-)和Thy-1(+)細胞，具備大鼠肝癌干細胞的初步特征。大鼠肝癌干細胞表面標志可能包括CK7(-)和Thy-1(+)。(2)

12、肝癌干細胞具備增殖能力低、致瘤能力強等生物學行為特征，并且具有分化能力。(3)不同大鼠來源的肝癌干細胞樣細胞表面標記表達率不同，提示不同大鼠肝癌干細胞比例不同。 第三部分間充質(zhì)干細胞與肝癌干細胞藥物敏感實驗 目的：研究肝癌大鼠間充質(zhì)干細胞與腫瘤細胞藥敏相關性，探討利用間充質(zhì)干細胞，進行針對肝癌干細胞藥物敏感實驗的可能性。方法：分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞與肝癌細胞，阿霉素(0.2μg/mL)、氟尿嘧啶(5μg/mL)及順鉑(1μ

13、g/mL)作用24h后，MTT法分別檢測化療藥物對間充質(zhì)干細胞與肝癌細胞的抑制率。同時，化療藥物作用后的肝癌細胞移植裸鼠，6周后測量移植瘤重量。氟尿嘧啶與順鉑對肝癌細胞抑制率與對間充質(zhì)干細胞抑制率進行配對t檢驗。氟尿嘧啶與順鉑對肝癌細胞抑制率，對間充質(zhì)干細胞抑制率與移植瘤重量間進行相關性分析。結(jié)果：(1)阿霉素，氟尿嘧啶與順鉑對肝癌大鼠間充質(zhì)干細胞抑制率分別為24.79±4.80，28.97±9.05與26.55±5.94。對肝癌細胞抑

14、制率分別為：46.50±9.67，55.68±12.53與51.42±10.80。阿霉素，氟尿嘧啶與順鉑對肝癌大鼠間充質(zhì)干細胞抑制率與對肝癌細胞抑制率比較有顯著性差異，t值與P值分別為：t=6.356，P＜0.001；t=5.006，P=0.001與t=5.743，P=0.001。(2)阿霉素，氟尿嘧啶與順鉑對肝癌細胞抑制率與其作用肝癌細胞后移植瘤重量間進行相關分析，具體相關系數(shù)為：阿霉素，r=0.245,P=0.559；氟尿嘧啶，F(xiàn)0

15、.144,P=0.734;順鉑，r=0.480,P=0.229，均無相關性?；熕幬飳Ω伟┐笫箝g充質(zhì)干細胞抑制率與對肝癌細胞間抑制率進行相關分析，具體相關系數(shù)為：阿霉素，r=0.249,P=0.552；氟尿嘧啶，r=0.073,P=0.863；順鉑，r=0.015,P=0.973,均無相關性。而化療藥物對肝癌大鼠間充質(zhì)干細胞抑制率與對應藥物作用后肝癌細胞移植瘤重量進行相關分析，具體相關系數(shù)為：阿霉素，r=-0.718，P=0.045；氟

16、尿嘧啶，r=-0.877，P=0.004；順鉑，r=-0.722，P=0.043?；熕幬飳﹂g充質(zhì)干細胞抑制率與肝癌細胞增殖侵襲能力有負相關性，并且相關有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：(1)化療藥物對肝癌大鼠間充質(zhì)干細胞抑制率小于對肝癌細胞抑制率，間充質(zhì)干細胞可能類似腫瘤干細胞，有獨特的耐藥機制。(2)化療藥物對肝癌細胞抑制率不能完全反映肝癌細胞增殖侵襲能力。化療藥物對間充質(zhì)干細胞抑制率可以較好反映肝癌細胞增殖侵襲能力。應用間充質(zhì)干細胞，有希望發(fā)展