生殖支原體GlpK和GlpO定位及酶活性與細胞毒性研究.pdf

1、研究背景:
　　生殖支原體(Mycoplasma genitalium，Mg)是目前能在無生命條件下生長的最小原核細胞型微生物，可引起急慢性尿道炎、陰道炎、子宮內膜炎、盆腔炎、輸卵管性不孕等多種疾病，并且作為AIDS相關支原體與患者的死亡密切相關。因此，開展對Mg的致病機制研究有利于提高對Mg相關疾病的認識和治療。
　　到目前為止，與其它致病菌相比，在支原體中至今未發(fā)現類似于毒素、侵襲素、溶細胞素等典型的毒力因子，這主要是由

2、于支原體基因組小，僅進化有維持基本生命功能的遺傳物質。因此，支原體可能通過內源性結構及其代謝產物作為毒性效應器從而發(fā)揮其致病作用。近年研究表明，支原體的致病性與其碳代謝密切相關，并且不同的支原體利用的碳源有所不同。越來越多的研究表明，許多微生物擁有一套完整的甘油利用系統(tǒng)，甘油可能涉及到其多種病理生理及致病過程。因此本課題擬選取Mg甘油代謝的兩個主要活性酶GlpK和GlpO，研究其定位和酶活性以及參與Mg細胞毒性中的作用。
　　研究

3、目的:
　　純化出GlpK蛋白和抗GST-GlpK抗體，檢測GlpK酶活性和GlpK參與Mg細胞毒性中的作用;純化出GlpO蛋白和抗GST-GlpO抗體，檢測GlpO定位與酶活性和GlpO參與Mg細胞毒性中的作用。
　　研究方法:
　　1、Mg GlpK的甘油激酶活性
　　構建原核表達載體pGEX6p-1/GlpK，誘導表達GST-GlpK融合蛋白，純化后免疫BALB/c小鼠取抗血清，進行鑒定和抗體效價測定，純化

4、pAb;純化出GlpK蛋白，檢測其酶活性及溫度和pH的影響。
　　2、Mg GlpO的細胞定位及3-磷酸甘油氧化酶活性
　　構建了原核表達載體pGEX6p-1/GlpO，誘導表達GlpO-GST融合蛋白，純化后免疫BALB/c小鼠取抗血清，進行鑒定和抗體效價測定，純化pAb;純化出GlpO蛋白，檢測其酶活性及溫度和pH的影響;分離Mg膜蛋白和胞漿蛋白，分析GlpO蛋白的細胞定位。
　　3、GlpK和GlpO對細胞毒性的

5、調控作用
　　電轉化構建、篩選和鑒定GlpK和GlpO功能缺陷株;濕重法繪制Mg的碳源生長曲線;Western blotting檢測碳源對GlpK或GlpO表達的影響;結合抗體抑制實驗檢測甘油代謝下Mg產生H2O2的量，觀察HeLa細胞的毒性變化和HeLa細胞內的氧化應激狀態(tài)。
　　研究結果:
　　1、PCR擴增出1524 bp目的片段，雙酶切和測序證實成功構建出pGEX6p-1/GlpK重組質粒，成功表達了83 kD

6、a的可溶性目的蛋白，純化目的蛋白免疫BALB/c小鼠制備獲得pAb，效價可達1∶16000;GST-GlpK融合蛋白經酶切后，純化出57 kDa的GlpK靶蛋白，測定其甘油激酶活性為1.73 U/mL，且隨溫度和pH值升高而升高。
　　2、PCR擴增出1152 bp目的片段，雙酶切及測序證實成功構建出pGEX6p-1/GlpO重組質粒，成功表達出68 kDa的可溶性目的蛋白，純化后目的蛋白免疫BALB/c小鼠制備獲得pAb，其效價

7、為1∶32000; GST-GlpO融合蛋白經酶切后純化出42 kDa的GlpO靶蛋白，測定其3-磷酸甘油氧化酶活性為4.26 U/mL，40℃和pH7時活性最高;GlpO蛋白在Mg胞膜和胞漿中均表達，但大部分位于胞漿中。
　　3、電轉化后未篩選出GlpK和GlpO突變株;在葡萄糖下Mg生長迅速，在未加碳源或甘油下生長緩慢;甘油組和抗GST-GlpK抗體組Mg產生的H2O2明顯高于未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組;甘油組和抗G

8、ST-GlpK抗體組的HeLa細胞存活率明顯低于未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組;甘油組的HeLa細胞胞內檢測出大量的H2O2和ROS，未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組未檢測出。
　　結論:
　　1、成功構建出pGEX6p-1/GlpK和pGEX6p-1/GlpO重組質粒，并成功表達出GST-GlpK和GST-GlpO重組蛋白。
　　2、GlpK具有甘油激酶活性;GlpO為跨膜蛋白，具有3-磷酸甘油氧化酶活性。