煤污病病原真菌比較和進(jìn)化基因組學(xué)及外寄生機(jī)制研究.pdf

1、煤污病是一種世界性的植物真菌病害，普遍發(fā)生于溫暖濕潤的國家和地區(qū)，能夠在蘋果、梨等果實(shí)以及毛竹、紫薇等觀賞植物的表面形成黑色的污斑和污點(diǎn)，導(dǎo)致其商品價(jià)值大幅下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。煤污病菌種類多樣，大部分歸屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)的多個(gè)科、屬。它們主要由植物寄生性致病菌演化而來，但通常都只定殖于寄主植物表皮層而不侵入寄主內(nèi)部，因而被認(rèn)為是特殊的植物病原真菌類群--"附生菌(epiphyte)"。近年來，國內(nèi)外對煤

2、污病菌的分類學(xué)、生物地理學(xué)、流行學(xué)和藥劑防治等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，但對于其在寄豐表面嚴(yán)苛環(huán)境下（營養(yǎng)不足、干旱、強(qiáng)紫外線等）的適應(yīng)機(jī)制仍不清楚。
　　本研究通過全基因組測序、比較基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合組織學(xué)技術(shù)揭示了煤污病病原真菌的致病機(jī)理和演化模式，主要得到以下結(jié)果:
　　果生月盾霉（Peltaster fructicola），一種常見的煤污病菌，基因組測序大小為18.14Mb，共預(yù)測出8，334個(gè)蛋白編碼基因，重復(fù)序

3、列比率為0.42％。與其它真菌相比，果生月盾霉屬于基因組大小、基因數(shù)目和重復(fù)序列比率均較少的物種。系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)顯示，果生月盾霉與半活體營養(yǎng)型小麥葉枯菌（Zymoseptoria tritici）的親緣關(guān)系相對較近，但前者在進(jìn)化中比后者丟失了更多的基因家族（1，019個(gè)vs.525個(gè)）卻獲得了較少的基因家族（58個(gè)vs.190個(gè)）;且孤兒基因在果生月盾霉中所產(chǎn)生的數(shù)量（1，485個(gè)）也遠(yuǎn)少于小麥葉枯菌（2，972個(gè)）。因此，果生月盾霉

4、應(yīng)是經(jīng)歷了一種收縮性的演化過程，即固有的基因發(fā)生大量遺失而新基因嚴(yán)重缺乏。推測果生月盾霉基因組結(jié)構(gòu)這種緊縮的特性可能與其極端的生存環(huán)境有關(guān)。
　　生物信息學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，果生月盾霉中僅含有107個(gè)外分泌蛋白編碼基因，遠(yuǎn)少于除釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）外的其它參與比較的腐生、共生和寄生真菌（166～991個(gè)），其中作為候選效應(yīng)蛋白的小分泌蛋白更是僅篩選出了12個(gè)，比上述所有真菌（16～343個(gè)）都要少。

5、這表明果生月盾霉缺少由分泌蛋白，尤其是效應(yīng)蛋白所介導(dǎo)的病原與寄主植物間互作。果生月盾霉中能夠編碼次級代謝產(chǎn)物合成核心酶的基因只有15個(gè)，少于包括小麥葉枯菌（28個(gè)）在內(nèi)的絕大多數(shù)植物病原真菌（18～82個(gè)），說明果生月盾霉可能缺乏侵染寄主植物所需的次級代謝物，如真菌毒素。同小麥葉枯菌中注釋到的68個(gè)植物細(xì)胞壁降解酶相比，果生月盾霉（24個(gè)）中主要缺少了β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶、β-1，4-內(nèi)切甘

6、露聚糖酶、果膠甲基酯酶、果膠酸鹽裂解酶和內(nèi)切鼠李半乳糖醛酸酶。這些酶類都會(huì)參與植物細(xì)胞壁重要成分（葡聚糖、木葡聚糖、木聚糖、半乳甘露聚糖、同聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸I）主鏈的降解，使得果生月盾霉無法突破植物表皮細(xì)胞壁。此外，轉(zhuǎn)錄組分析也顯示，以上三類植物致病相關(guān)基因在果生月盾霉侵染寄主過程中大多是低表達(dá)甚至不表達(dá)的。同樣屬于植物細(xì)胞壁降解酶的角質(zhì)酶編碼基因被較為完整的保留并具有相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步證明了該煤污病菌的外致病性。為了適

7、應(yīng)寄主表面的極端環(huán)境，屬于次級代謝產(chǎn)物的DHN-黑色素的合成相關(guān)基因也被保留。
　　通過對被侵染的蘋果表皮進(jìn)行組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，果生月盾霉在寄主表面擴(kuò)展時(shí)不僅能夠分解植物表層蠟質(zhì)，還能在其類菌核體下方降解并穿透部分真角質(zhì)層，這種定殖策略無疑有利于該病原菌在寄主植物表皮上的附著并從其中獲取所需的營養(yǎng)物質(zhì)。因此筆者提出，果生月盾霉作為一種能夠全程在寄主植物體外進(jìn)行寄生生長的病原菌應(yīng)被定義為"外寄生菌(ectophyte)"，而非是營腐生

8、生活的"附生菌"。
　　綜上所述，果生月盾霉在由植物穿透型病原真菌向煤污病菌演化的過程中，基因組發(fā)生顯著收縮，放棄了大量致病性相關(guān)的基因，卻保留了一些與寄主植物表面定殖有關(guān)的功能，最終形成了一種獨(dú)特的植物外寄生營養(yǎng)模式。而這種演化方式可能有助于病原菌逃避寄主的?；院兔庖叻佬l(wèi)反應(yīng)，進(jìn)而適應(yīng)迅速改變的生態(tài)環(huán)境。
　　為了明確果生月盾霉的基因組演化方式在整個(gè)煤污病菌類群中的普遍性，筆者對另外三種煤污病菌--蘋果小疊孢(Micro

9、cyclosporella mali)、角狀平臍疣孢（Zasmidium angulare）和仁果疊孢（Microcyclospora pomicola）的基因組進(jìn)行了測序，并與它們各自的近緣植物穿透型寄生菌--桉樹葉斑病菌（Mycosphaerella madeirae）、柑橘膩斑病菌（Zasmidium citri）和桉樹葉斑病菌（Teratosphaeria nubilosa）進(jìn)行了比較基因組分析。結(jié)果顯示，這三種煤污病菌在基因組

10、大小(26.7Mb vs.32.2Mb;36.2Mb vs.42.9Mb;22.4Mb vs.27.1Mb)、基因數(shù)量(11，572個(gè)vs.14，017個(gè);14，946個(gè)vs.17，275個(gè);9，169個(gè)vs.10，998個(gè))以及重復(fù)序列比率(1.57％vs.6.09％;3.60％vs.8.35％;1.95％vs.7.88％)等方面均小于穿透型病原菌，表明它們的基因組結(jié)構(gòu)同樣具有緊縮特性。而且，相比于穿透型病原菌，這三種煤污病菌在外分泌

11、蛋白（488個(gè)vs.633個(gè);887個(gè)vs.1，142個(gè);339個(gè)vs.484個(gè)）、植物細(xì)胞壁降解酶（75個(gè)vs.98個(gè);140個(gè)vs.160個(gè);34個(gè)vs.75個(gè)）、次級代謝產(chǎn)物合成核心酶（29個(gè)vs.47個(gè);34個(gè)vs.49個(gè);19個(gè)vs.23個(gè)）和MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（296個(gè)vs.396個(gè);511個(gè)vs.596個(gè);195個(gè)vs.242個(gè)）等植物致病因子的數(shù)量上也一致表現(xiàn)出了縮減，這意味著其侵入能力的減弱。因此，筆者認(rèn)為煤污病菌的基因組