特異性DNA甲基化譜在動脈粥樣硬化性疾病早期診斷中的實驗研究.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種由遺傳和環(huán)境等多因素共同參與的慢性復(fù)雜性病變，其所致的心腦血管疾病是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率和死亡率居各類疾病之首。但AS的早期分子診斷標(biāo)志物及方法尚未完全闡明。DNA甲基化是DNA基因堿基序列沒有改變而功能發(fā)生變化，是除遺傳學(xué)調(diào)控基因表達(dá)外又一重要調(diào)控方式，是聯(lián)系遺傳和環(huán)境因素的紐帶；且DNA甲基化現(xiàn)象比臨床癥狀出現(xiàn)更早，疾病未出現(xiàn)臨床癥狀前DNA

2、甲基化即已發(fā)生了典型改變，因此，DNA甲基化被認(rèn)為是AS早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。但以往大多局限于對單個或少數(shù)基因甲基化的研究，而AS作為多因素復(fù)雜性疾病，其基因表型和疾病表型間的復(fù)雜關(guān)系并不能通過將單個基因的獨立作用進(jìn)行簡單的加和來充分解釋，僅依靠單個或少數(shù)基因的異常甲基化狀況判斷AS的發(fā)展?fàn)顩r是不準(zhǔn)確的，因此，如能從多基因水平尋找出AS表遺傳標(biāo)志物，找到有效的早期診斷方法和干預(yù)手段，指導(dǎo)AS的靶向性治療及潛在的干預(yù)靶點尋找，對提高人們

3、生活水平和質(zhì)量有不可估量的作用，產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟、社會效益，有廣闊的推廣應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化前景。
　　目的：揭示AS發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)甲基化異常的AS相關(guān)基因，建立AS性疾病早期分子診斷特異性DNA甲基化譜，并同步研究AS發(fā)生發(fā)展中特異性DNA甲基化譜的早期風(fēng)險評估及診斷作用，了解AS發(fā)生發(fā)展過程中甲基化異常的表遺傳學(xué)機制。
　　方法：分別在NCBI和OMIM中檢索關(guān)鍵詞“動脈粥樣硬化”，篩選出118個AS相關(guān)基因；然后，經(jīng)UCSC

4、和CpG Island Searcher在線軟件分別分析基因啟動子序列并預(yù)測CpG島，遴選出富含CpG島的基因38個；根據(jù)基因表達(dá)位置及其調(diào)控方式的差異，排除外周血中不表達(dá)及主要受基因多態(tài)性調(diào)控的10個基因；進(jìn)一步根據(jù)甲基化數(shù)據(jù)庫methDB的分析，并最終篩選出富含CpG的12個基因亞型展開重點研究。以年齡30-60歲AS寧夏人群為研究對象，選擇2011年5月至2012年9月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科就診和體檢者。研究對象于清晨、空腹?fàn)顟B(tài)

5、下抽取靜脈血10 ml，當(dāng)日由全自動生化分析儀完成臨床生化指標(biāo)甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的檢測。經(jīng)臨床癥狀和血脂指標(biāo)等檢測，并經(jīng)頸動脈多普勒超聲確診后，分為兩組，每組各50例，提取AS患者和對照組DNA和RNA。提取后的DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾，巢氏降落式甲基化特異性PCR（ntMS-PCR）檢測ABCA1、ACAT、PPARα、PDGFβ、5-LO、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEG

6、F、NFκB 12個基因的甲基化啟動子區(qū)CPG島甲基化的改變。結(jié)果顯示ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1 和5-LO五個基因的甲基化程度在兩組間差異顯著(P<0.01)；統(tǒng)計分析后，選擇特異性和敏感性較高的TIMP-1、ACAT1、ABCA1三個基因建立AS特異性DNA甲基化譜，運用RT-PCR法檢測其建譜基因的mRNA表達(dá)，探討差異基因的DN A甲基化和基因表達(dá)的關(guān)系。另外收集臨床上診斷為AS的病人和正常人，共100例，

7、在實驗一的基礎(chǔ)上，并分析DNA甲基化譜（TIMP-1、ACAT1、ABCA1）中多個基因甲基化的改變，并與與頸動脈多普勒超聲診斷相比，評價特異性DNA甲基化譜在動脈粥樣硬化性疾病早期分子風(fēng)險評估及診斷價值。
　　結(jié)果：在AS特異性甲基化譜分析中，候選的12個基因（ABCA1、ACAT、PPARα、PDGFβ、5-LO、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEGF和NFκB）啟動子區(qū)域 CpG島甲基化狀態(tài)分析

8、發(fā)現(xiàn)，TIMP-1(P<0.01)、ACAT1(P<0.01)、ABCA1(P<0.01)、5-LO(P<0.05)和PPARα(P<0.05)這五個基因的DNA甲基化程度在兩組之間有顯著性差異，且TIMP-1、ACAT、ABCA1的靈敏度和特異度較好。聯(lián)合檢測TIMP-1、AC AT1、ABCA1的DNA甲基化程度，和頸動脈多普勒超聲相比，靈敏度和特異度分別是88％、70%，一致性79%，這一結(jié)果顯示了DNA甲基化譜具有AS風(fēng)險評估中

9、的價值。
　　結(jié)論：1. ACAT1、PPARα 、TIMP-1、ABCA1、5-LO DNA甲基化在對照組和AS組有顯著差異，說明相關(guān)基因的DN A甲基化是AS早期的、頻發(fā)的事件且甲基化改變對診斷AS有特異性。2. TIMP-1、ACAT1、ABCA1三個基因甲基化改變對診斷AS有較好的特異度和靈敏度，可作為臨床研究的備選分子生物學(xué)標(biāo)志物。3.聯(lián)合檢測TIMP-1、ACAT1、ABCA1三個基因，其甲基化異常狀態(tài)具有動脈粥樣硬化