神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、各種原因所致耳蝸不可逆性的缺失，引起隨之發(fā)生的螺旋神經(jīng)節(jié)和聽(tīng)神經(jīng)的凋亡和變性，從而導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生。隨著人工耳蝸植入術(shù)(CI)，的發(fā)展，多數(shù)保留有足夠數(shù)量螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGNs)的耳聾患者在這項(xiàng)技術(shù)中受益，聽(tīng)力得到提高。具有一定正常形態(tài)和功能SGNs的數(shù)量對(duì)于CI技術(shù)的發(fā)展是一個(gè)限制性的因素，通常認(rèn)為殘存的SGNs的數(shù)量應(yīng)占總量的10％以上。SGNs的存活依賴于聽(tīng)覺(jué)感受器、蝸核、髓鞘等分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；除此之外，還依賴于毛細(xì)

2、胞釋放的神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸、P物質(zhì)和乙酰膽堿等誘發(fā)的SGNs細(xì)胞膜的生物電活動(dòng)。 在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活、再生、軸突的塑型和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF起著不可忽視的作用。NGF是一種高效多能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，由三種亞基α、β、γ，按α<,2>βγ<，2>的排列組成，分子量為1300000D，其中只有β亞基具有生物學(xué)作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期，具有促進(jìn)神經(jīng)元的分化，控制神經(jīng)元存活數(shù)量等作用；在神經(jīng)元發(fā)育成熟期，具有維

3、持感覺(jué)神經(jīng)元和中樞神經(jīng)元群的功能，促進(jìn)成熟神經(jīng)元軸索分支等作用；神經(jīng)損傷修復(fù)期，NGF具有類似發(fā)育期的作用，支持神經(jīng)元的存活并促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)。Lefebvre等在培養(yǎng)的大鼠耳蝸前庭神經(jīng)節(jié)中加入胚胎12天的聽(tīng)泡，發(fā)現(xiàn)聽(tīng)泡能釋放出一種因子促進(jìn)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的存活和軸突的發(fā)生，這種因子的作用類似NGF，其作用能被抗MGF抗體阻斷。 NGF是與其受體相結(jié)合后發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，高親和力TrkA受體被公認(rèn)為．NGF功能性受體，與NGF結(jié)合

4、能使細(xì)胞內(nèi)絡(luò)氨酸蛋白激酶活性增高，繼而發(fā)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終達(dá)到維持細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞成熟的效應(yīng)。Dai在用兔的抗TrkA的多克隆抗體對(duì)嚙齒類動(dòng)物(大鼠、小鼠)進(jìn)行NGF受體TrkA分布的研究，發(fā)現(xiàn)在大鼠和小鼠中的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均有TrkA的表達(dá)。通過(guò)與受體的結(jié)合，NGF發(fā)揮對(duì)SGNs的保護(hù)作用。 目前外源性NGF直接提純較為困難，來(lái)源受限；并且因其屬于大分子物質(zhì)，不易通過(guò)血一迷路屏障，臨床應(yīng)用存在著很大的難度。內(nèi)耳包被于骨性

5、結(jié)構(gòu)內(nèi)，并因血一迷路屏障的存在而與周圍組織形成相對(duì)獨(dú)立的微環(huán)境，由于膜性迷路懸浮于內(nèi)、外淋巴的液態(tài)環(huán)境之中，淋巴液的不斷循環(huán)流動(dòng)，有利于轉(zhuǎn)移載體在膜迷路系統(tǒng)的擴(kuò)散，賦予內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)移自身的特點(diǎn)。腺病毒是一種線性雙鏈DNA病毒，能感染所有類型的細(xì)胞，對(duì)糾正神經(jīng)細(xì)胞的基因缺陷有特殊意義，表達(dá)效率高，具有較高的安全性，是一類適合內(nèi)耳基因治療的載體。為了研究外源性β NGF能否經(jīng)病毒介導(dǎo)感染螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，發(fā)揮對(duì)SGNs的存活作用，我們首先研究了

6、β NGF在不同發(fā)育階段豚鼠耳蝸中的分布規(guī)律，間接了解βNGF在不同階段對(duì)耳蝸各部分的作用；然后構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因和βNGF目的片斷的重組腺病毒表達(dá)載體AD-β NGF，將AD-β NGF感染離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和基底膜后并在細(xì)胞和組織中獲得了表達(dá)；通過(guò)圓窗膜注射將AD-βNGF導(dǎo)入豚鼠膜迷路內(nèi)，病毒成功感染柯替器及SGNs；在藥物性耳聾動(dòng)物模型中，導(dǎo)入β NGF的SGNs存活情況較好，但在腦干誘發(fā)電位測(cè)試中Ⅲ波的聽(tīng)閾值

7、較正常值增高。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、選取胚胎20天、出生后7天和成年的豚鼠，常規(guī)制備耳蝸石蠟切片，兔抗小鼠βNGF多克隆抗體(1：200)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示胚胎20天的豚鼠耳蝸外嵴部(分化形成柯替器)的細(xì)胞胞漿染色陽(yáng)性，蝸軸中與外嵴部延續(xù)的細(xì)胞(幼稚螺旋神經(jīng)節(jié))胞漿染色陽(yáng)性。出生7天和成年的豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞β NGF染色為陽(yáng)性，發(fā)自神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的染色陽(yáng)性的神經(jīng)纖維支配內(nèi)外毛細(xì)胞；基底膜上內(nèi)、外毛細(xì)胞染色強(qiáng)陽(yáng)性(深

8、棕黃色)，蝸軸中排列成束的神經(jīng)纖維染色也為陽(yáng)性。經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡行定量檢測(cè)提示在這三個(gè)發(fā)育階段出生后7dNGF含量最多，成年后含量最少。 2、從小鼠頜下腺組織提取總RNA后，用RT-PCR法擴(kuò)增了924bp長(zhǎng)度的小鼠βNGF基因cDNA，經(jīng)過(guò)電泳、回收、純化后與攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv-eGFP重組成pAdtrack-cmv-eGFP．β NGF，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在細(xì)菌中擴(kuò)增質(zhì)粒，

9、經(jīng)過(guò)質(zhì)粒抽提、酶切、電泳、回收后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1同源重組，經(jīng)酶切鑒定、電泳分析和DNA測(cè)序鑒定，924bp的βNGF基因片斷成功插入到腺病毒載體中，插入方向正確。和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)后確認(rèn)無(wú)誤，說(shuō)明載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在293細(xì)胞中包裝成具有感染能力的完整的腺病毒顆粒。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的第二天即有部分293細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，發(fā)出GFP的293

10、細(xì)胞數(shù)目增多，在轉(zhuǎn)染第7～10天時(shí)最多，熒光最強(qiáng)，細(xì)胞的形態(tài)較正常有變化，形成串珠狀，以后逐漸減弱，發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)減少。在轉(zhuǎn)染的第7～10天是采集病毒液的最佳時(shí)期。將細(xì)胞破碎離心后，取上清，重復(fù)感染293細(xì)胞，3天左右即可再次收集病毒液，達(dá)到快速擴(kuò)增病毒液的目的。經(jīng)TCID50法測(cè)定，收集的病毒液滴度達(dá)1×10<'7.4>PFU/mL。以病毒液為模板，通過(guò)βNGF目的基因引物PCR擴(kuò)增出924bp的目的基因片段，說(shuō)明腺病毒是重組的，排

11、除了在包裝病毒液的過(guò)程中野生型腺病毒的產(chǎn)生。 3、在解剖顯微鏡下分離出生3～5d的小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，經(jīng)消化后移入涂有0.1％多聚賴氨酸的平皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)中，SGNs一般在12h左右貼壁，24h后呈良好長(zhǎng)勢(shì)，連續(xù)培養(yǎng)7d細(xì)胞體形態(tài)良好，軸突長(zhǎng)度無(wú)明顯改變，培養(yǎng)到第14d左右，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞體中可見(jiàn)空泡，軸突變小變細(xì)，多數(shù)細(xì)胞崩解。將病毒液在培養(yǎng)后第2d加入培養(yǎng)液中，顯微鏡下觀察綠色熒光，在轉(zhuǎn)染后第2d可見(jiàn)部分細(xì)胞發(fā)出熒

12、光，熒光很弱，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)增多，熒光也隨之增強(qiáng)，處于細(xì)胞體的熒光較軸突強(qiáng)，有些細(xì)胞的熒光主要集中在細(xì)胞核周圍，轉(zhuǎn)染第5d，熒光數(shù)最多最強(qiáng)，連續(xù)培養(yǎng)14天，多數(shù)細(xì)胞胞體和突起的形態(tài)較正常無(wú)明顯改變。經(jīng)SGNs計(jì)數(shù)，非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞減少明顯較轉(zhuǎn)染組顯著(P<0.05)。 4、重組腺病毒轉(zhuǎn)染三維離體培養(yǎng)的基底膜，第7天，基底膜上發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)最多，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，綠色熒光蛋白的表達(dá)在螺旋神經(jīng)節(jié)

13、細(xì)胞、神經(jīng)纖維、毛細(xì)胞中最強(qiáng)；連續(xù)培養(yǎng)14天，基底膜上細(xì)胞的層次分明，組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯改變，組織的有序性明顯高于非轉(zhuǎn)染組。 5、為了檢測(cè)β NGF對(duì)活體耳蝸和SGNs的保護(hù)作用，豚鼠隨機(jī)分成四組：病毒組A，慶大霉素組B，病毒組+慶大霉素組C，正常組D。通過(guò)圓窗膜將病毒液注入豚鼠耳蝸鼓階中，注射后以顳肌筋膜貼附在圓窗上，窗緣周圍用軟組織填塞以防病毒液滲漏。B組耳蝸內(nèi)不注射病毒液，每日肌注慶大霉素80mg/kg，連續(xù)10天。C組在耳

14、蝸?zhàn)⑷氩《疽汉蟮谌烀咳占∽c大霉素80mg/kg，連續(xù)10天。于感染后第10～12d處死動(dòng)物，檢測(cè)各組豚鼠ABR聽(tīng)閾值，處死后制備石蠟切片，甲苯胺藍(lán)染色觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞尼氏小體形態(tài)和數(shù)目。在病毒組A中，ABR引出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ波，Ⅲ波聽(tīng)閾與正常無(wú)顯著性差異(p>0.05)。在慶大霉素的干預(yù)下，慶大霉素組腦干誘發(fā)電位無(wú)明顯波形引出；病毒組+慶大霉素組C有波形引出，但是聽(tīng)閾值高于正常(p<0.05)。慶大霉素B組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞尼氏小體多

15、數(shù)分解，病毒組+慶大霉素C組尼氏小體少數(shù)分解，大部分仍保持正常形態(tài)。 通過(guò)觀察β NGF在耳蝸不同發(fā)育階段的分布和量的變化，了解了β NGF在耳蝸不同發(fā)育階段中的地位和作用；成功構(gòu)建了攜帶βNGF基因片段的腺病毒表達(dá)載體AD-βNGF；將病毒液轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的SGNs和耳蝸基底膜，觀察β NGF對(duì)SGNs直接和間接的保護(hù)作用，為后續(xù)的研究打下了基礎(chǔ)；AD-β NGF成功感染了活體的耳蝸，感染范圍廣，未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性和炎性反應(yīng)，