缺氧與NaCN中毒大鼠肺損傷特點(diǎn)及其機(jī)制初步研究.pdf

1、氫氰酸是極為重要的工業(yè)毒物，也是外軍裝備的速殺性化學(xué)戰(zhàn)劑，《禁止化學(xué)武器公約》將其列為“雙用途毒劑”。分子結(jié)構(gòu)中含有氰根(CN-)的化合物多具有強(qiáng)烈毒性，人們稱(chēng)它們?yōu)榍桀?lèi)毒劑或氰化物。氰化物進(jìn)入機(jī)體后迅速釋放出氰離子(CN-)，CN-對(duì)細(xì)胞呼吸鏈有很強(qiáng)的親和力，可與細(xì)胞色素氧化酶的三價(jià)鐵(Fe3+)結(jié)合，抑制該酶的活性⑴，阻斷呼吸鏈電子傳遞，造成“內(nèi)呼吸”障礙。呼吸衰竭和心血管功能衰竭是氰化物中毒死亡的主要原因。 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)

2、胞(alveolarepithelialcellTypeⅡ，AECⅡ)是一種多功能細(xì)胞，對(duì)維持肺泡的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，肺組織對(duì)缺血、缺氧損傷敏感。其中肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的位置比較特殊，容易受到來(lái)自空氣和血液兩方面的損害。因此，AECⅡ在急性肺損傷后的變化非常復(fù)雜。急性肺損傷(ALI)肺組織的病理變化為肺泡上皮細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡，形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，呼吸膜的完整性遭到破壞，導(dǎo)致其功能異常，主要表現(xiàn)為肺表

3、面活性物質(zhì)(pulmonarysurfactant，PS)系統(tǒng)的異常，表面活性物質(zhì)是呼吸不可缺少的物質(zhì)，這種基本物質(zhì)的缺乏、不足和失活是引起嚴(yán)重呼吸功能失調(diào)的原因。近年來(lái)，隨著對(duì)急性肺損傷發(fā)病機(jī)制及防治措施研究的深入，發(fā)現(xiàn)急性肺損傷時(shí)常伴有表面活性蛋白含量的降低。AECⅡ的增殖和分化不僅可以修復(fù)肺泡的正常結(jié)構(gòu)，更可以有效地進(jìn)行功能上的恢復(fù)，從而阻止肺損傷向ARDS發(fā)展。AECⅡ是肺泡上皮細(xì)胞的干細(xì)胞，AECⅡ細(xì)胞的凋亡在ALI的病理過(guò)程

4、中至關(guān)重要。 為了闡明缺氧復(fù)合氰化物中毒對(duì)肺損傷的特點(diǎn)及其機(jī)制，本課題以肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞為研究目標(biāo)，從缺氧與NaCN中毒對(duì)整體動(dòng)物呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的影響及對(duì)離體AECⅡ毒性作用研究，從肺組織及AECⅡ結(jié)構(gòu)變化、肺血管通透性、BALF和肺組織均漿主要成分改、氧化應(yīng)激狀態(tài)變化以及AECⅡ合成SP-A的能力、相關(guān)凋亡基因HIF-1α和P53蛋白表達(dá)情況等方面，研究復(fù)合缺氧損傷引起AECⅡ功能狀態(tài)改變與急性肺損傷的關(guān)系，以進(jìn)一步明

5、確復(fù)合缺氧損傷AECⅡ發(fā)生凋亡的可能機(jī)制，為缺氧和NaCN中毒后導(dǎo)致的急性肺損傷的診斷和防治提供理論依據(jù)。 方法：1:大鼠缺氧與NaCN中毒損傷模型：高原實(shí)驗(yàn)組預(yù)缺氧72h后皮下注射N(xiāo)aCN3.60mg/K。利用光鏡和免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠肺組織病理?yè)p傷、SP-A活性改變以及AECⅡ凋亡相關(guān)基因HIF-1α和P53的表達(dá)情況；多道生理信號(hào)記錄系統(tǒng)觀察缺氧和NaCN中毒對(duì)大鼠呼吸功能的影響；生化分析測(cè)定肺血管通透性變化、BALF

6、成分變化趨勢(shì)和肺組織。2：離體AECⅡ缺氧與NaCN中毒模型：觀察NaCN對(duì)AECⅡ的毒性作用；WesternBlot測(cè)定SP-A，HIF-1α和P53蛋白表達(dá)情況；PI-3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002，P53抑制劑PFT-α對(duì)缺氧與NaCN中毒AECⅡ生成SP-A的干預(yù)作用。 結(jié)果： 一、缺氧與NaCN中毒動(dòng)物模型 1、缺氧和氰化鈉中毒大鼠肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理?yè)p傷，肺泡間質(zhì)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變，并出現(xiàn)變性

7、損傷。缺氧和氰化鈉中毒大鼠AECⅡ變性損傷顯著，板層體排空，細(xì)胞呈空泡狀。 2、缺氧和(或)氰化鈉中毒可誘導(dǎo)大鼠肺組織HIF-1α、P53表達(dá)增強(qiáng)，SP-A表達(dá)減弱。 3、常氧大鼠NaCN中毒后肺干濕質(zhì)量比、肺體比值增加，缺氧大鼠NaCN中毒肺干濕質(zhì)量比、肺體比值在各時(shí)相點(diǎn)均明顯高于常氧對(duì)照組、缺氧對(duì)照組(P＜0.05)。 4、常氧NaCN中毒增加大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)，缺氧中毒組支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)

8、各時(shí)相點(diǎn)均明顯高于常氧中毒組、缺氧對(duì)照組(P＜0.01)。 5、常氧NaCN中毒增加大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量，缺氧中毒組支氣管肺泡灌沈液中蛋白含量各時(shí)相點(diǎn)均明顯高于常氧中毒組，缺氧對(duì)照組(P＜0.01)。 6、常氧NaCN中毒升高大鼠BALF的TPL含量，缺氧對(duì)照組TPL含量明顯高于常氧對(duì)照組，皮下注射N(xiāo)aCN后，TPL顯著高于缺氧對(duì)照組(P＜0.05)。常氧NaCN中毒后肺組織TPL含量顯著下降，缺氧對(duì)照組肺組織

9、中TPL含量低于常氧對(duì)照組NaCN染毒后進(jìn)一步下降(P＜0.05)。 7、常氧大鼠NaCN中毒后肺組織伊文思藍(lán)含量先增高后逐漸恢復(fù)，中毒1h左右為肺損傷高峰期。缺氧大鼠NaCN中毒后肺組織伊文思藍(lán)含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞增，各時(shí)相點(diǎn)均明顯高于常氧中毒組和缺氧對(duì)照組(P＜0.01)。NaCN中毒動(dòng)物后BALF中LDH、ACP及AKP活性明顯增高，0.5h最高，在缺氧與NaCN中毒后BALF中LDH、ACP及AKP活性明在同一時(shí)相點(diǎn)明顯高

10、于單純NaCN中毒(P＜0.01)。 8、NaCN中毒后肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的GSH含量、SOD活力、GSH-PX活力的下降、MDA的含量增加。各指標(biāo)的變化幅度遠(yuǎn)大于單純NaCN中毒的效應(yīng)(P＜0.01)。 二、缺氧與NaCN中毒AECⅡ模型 1、氰化鈉對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有毒性作用。氰化鈉染毒后肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)變化明顯，胞體變圓，細(xì)胞突起變短或消失，胞核形態(tài)不規(guī)則；隨著染毒劑量的增大，損傷程度明顯加重

11、，胞漿內(nèi)出現(xiàn)中毒顆粒，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 2、氰化鈉可顯著降低肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞活力。染毒濃度越高，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞活力越低，并存在明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系(P＜0.01)。 3、缺氧或(和)NaCN中毒導(dǎo)致體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞SP-A表達(dá)明顯降低，在缺氧與NaCN中毒時(shí)降至最低，與單一缺氧因素作用有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在NaCN中毒或缺氧情況下，均可引起AECⅡ內(nèi)P53蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，缺氧組與NaCN中毒組有

12、明顯差異(P＜0.01)。在NaCN中毒或缺氧情況下，均可引起AECⅡ內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。缺氧與NaCN中毒時(shí)，AECⅡ的HIF-1α蛋白表達(dá)為正常對(duì)照組的8.5倍(P＜0.01)。 4、使用LY294002或PFT-α預(yù)處理AECⅡ，可以顯著的提高復(fù)合缺氧損傷SP-A含量的減少(P＜0.01)。兩種抑制劑同時(shí)作用胞內(nèi)SP-A含量是復(fù)合缺氧損傷組的428％(P＜0.01)。與缺氧復(fù)合損傷組相比，加入藥物L(fēng)Y294002

13、干預(yù)的AECⅡ內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)降低了55％(P＜0.01)。加入PFT-α預(yù)處理的AECⅡ內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)與LY294002干預(yù)組有明顯差異(P＜0.01)。LY294002和PFT-α均可降低缺氧與NaCN中毒AECⅡ的P53蛋白的表達(dá)。與缺氧復(fù)合損傷組比較，PFT-α預(yù)處理組AECⅡ的P53蛋白表達(dá)降低最顯著，降低了76.7％(P＜0.01)。LY294002干預(yù)組降低P53蛋白的表達(dá)量22.4％(P＜0.01)，聯(lián)合用

14、藥組降低P53蛋白的表達(dá)量38％(P＜0.01)。 結(jié)論： 1、成功建立了大鼠缺氧與NaCN中毒動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧與NaCN中毒對(duì)大鼠呼吸頻率的改變表現(xiàn)為出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，變化大。缺氧環(huán)境下氰化鈉中毒所造成的呼吸頻率變化比平原組嚴(yán)重而持久。提示缺氧和氰化鈉中毒對(duì)呼吸功能可能有聯(lián)合損傷效應(yīng)。病理組織檢查檢查發(fā)現(xiàn)缺氧或(和)NaCN對(duì)大鼠肺組織具有損傷作用，可使肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理改變，肺泡間質(zhì)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變，

15、并出現(xiàn)變性損傷。超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)AECⅡ變性損傷顯著，板層體排空，細(xì)胞呈空泡狀。AECⅡ發(fā)生形態(tài)學(xué)改變并發(fā)生變性損傷，可能是導(dǎo)致缺氧和NaCN中毒肺急性損傷的根本原因。 2、肺體比值、肺干濕質(zhì)量比、BALF中的細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白含量、總磷脂含量與肺血管通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，缺氧或NaCN中毒均可損傷肺泡的組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致通透性增加，液體自血管滲入肺泡和間質(zhì)中，BALF中蛋白含量增高可能是BALF中TPL含量先增高然后隨著PS的滅活而

16、降低，肺組織TPL下降提示肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生損傷。在缺氧與NaCN中毒后BALF中LDH、ACP及AKP活性明在同一時(shí)相點(diǎn)明顯高于單純NaCN中毒(P＜0.01)，提示缺氧和氰化鈉中毒的毒性對(duì)大鼠肺損傷作用加強(qiáng)。 3、NaCN中毒后肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的GSH含量、SOD活力、GSH-PX活力的下降、MDA的含量增加。各指標(biāo)的變化幅度遠(yuǎn)大于單純NaCN中毒的效應(yīng)(P＜0.01)。提示氧化應(yīng)激機(jī)制在缺氧復(fù)合氰化物中毒中發(fā)揮一定

17、作用。 4、缺氧或(和)NaCN中毒導(dǎo)致體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞SP-A表達(dá)明顯降低，P53蛋白、HIF-1α蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。SP-A的變化可能是BALF中總蛋白含量和總磷脂含量先升高后降低的主要原因之一。在缺氧與NaCN中毒時(shí)SP-A表達(dá)降至最低，提示兩種缺氧因素可能加重AECⅡ的損傷，AECⅡ功能損傷可能與P53、HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，HIF-1α可能是AECⅡ凋亡途徑的樞紐信號(hào)。 5、使用LY294002或(和