光棘球海膽SRB與Lectin基因的克隆、原核表達與功能研究.pdf

1、光棘球海膽（Strongylocentrotus nudus），俗名大連紫海膽，在分類地位上屬于棘皮動物門-海膽綱-球海膽科，是中國北方海域的重要經(jīng)濟海膽種類，也是中國本土優(yōu)良品種，其豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值使之廣受消費者的喜愛。但是，截至目前為止，中國的光棘球海膽?zhàn)B殖業(yè)仍然受到病害、種質(zhì)、營養(yǎng)等諸多問題的困擾。對于缺乏后天免疫系統(tǒng)的海膽等棘皮動物而言，其先天免疫系統(tǒng)是抵御外來病原侵襲的關(guān)鍵;生長相關(guān)基因的克隆和表達水平的研究也有助于促

2、進海膽的健康養(yǎng)殖。研究海膽先天免疫和生長發(fā)育相關(guān)基因，能夠為其良種選育提供必要的理論依據(jù)。B型清道夫受體和凝集素是兩種典型的在免疫過程和發(fā)育過程中均發(fā)揮功能的基因。在本研究中，采用基因克隆、原核表達、實時定量、抑菌實驗的方法對光棘球海膽B(tài)型清道夫和凝集素進行研究，主要結(jié)果如下：
　　1)克隆了3個光棘球海膽B(tài)型清道夫受體和2對凝集素基因的編碼區(qū)。對于3對光棘球海膽的B型清道夫受體，分別將它們命名為SRB-1、SRB-2、SRB-3

3、。其中，SRB-1的編碼區(qū)長度1632bp，一共編碼543個氨基酸，分子量大約為61.9kDa，3'UTR區(qū)長度是315bp;SRB-2編碼區(qū)長度為1653bp，編碼了550個氨基酸，分子量大約為62.9kDa，3'UTR區(qū)長度為220bp;SRB-3編碼區(qū)長度為1512bp，編碼503個氨基酸。信號肽預測的結(jié)果表明，光棘球海膽這3對B型清道夫受體均無信號肽。SRB-1和SRB-2兩對清道夫受體的3'UTR區(qū)與已知的加州紫海膽與光棘球海

4、膽的mircoRNA（簡稱miRNA）之間的作用關(guān)系進行了分析，結(jié)果表明這兩對光棘球海膽的B型清道夫受體是不受的海膽miRNA調(diào)控的。
　　2)所克隆的2對光棘球海膽的凝集素基因分別為半乳糖凝集素8和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜凝集素。前者的編碼區(qū)長度為939bp，一共編碼312個氨基酸，分子量大約為34.98kDa，等電點約為9.40，將該基因簡寫為Gal-8;后者的編碼區(qū)長度為1371bp，一共編碼456個氨基酸，將該基因簡寫為E-lectin。

5、
　　3)光棘球海膽SRB-1、SRB-2基因的胞外區(qū)和Gal-8進行了原核表達并對這3個重組蛋白的免疫功能進行了初步探索。體外實驗發(fā)現(xiàn)這3個蛋白能夠抑制大腸桿菌、鰻弧菌的生長，但不能抑制溶藻弧菌的生長。通過實時定量PCR的方法，比較了這3個基因在不同發(fā)育階段的海膽個體中的表達水平。
　　本研究克隆了光棘球海膽免疫和生長發(fā)育相關(guān)的5個基因，表達了2個B型清道夫受體的胞外區(qū)蛋白和半乳糖凝集素8（Gal-8）的蛋白，對其功能進行