鎂離子對內(nèi)耳保護(hù)性作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鎂作為一種二價陽離子，在細(xì)胞中含量豐富。在體內(nèi)參與幾百種酶反應(yīng)，包括所有需要腺苷酸環(huán)化酶的過程，如ATP，Na+/K+-ATP酶，和磷脂酶C。耳蝸的神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)方面變化的復(fù)雜性，如果鎂缺乏，其對內(nèi)耳細(xì)胞功能，微循環(huán)和活性氧的形成等方面造成的影響是嚴(yán)重的；另外細(xì)胞外鎂離子是天然生理性鈣離子通道阻滯劑。而在缺血、缺氧及噪聲等損害因素的作用下，在內(nèi)耳傳入神經(jīng)突觸間隙表現(xiàn)為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的堆積，過量的谷氨酸過度激活NMDA受體，鈣離子通

2、道病理性開放，引起大量鈣離子內(nèi)流，過多的鈣激活細(xì)胞內(nèi)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，如氧自由基的增多，細(xì)胞膜的通透性增加等等從而引起細(xì)胞受到損傷。如果增加鎂，是否可以改善這些病理變化呢?本課題通過細(xì)胞培養(yǎng)和噪聲性聾大鼠為研究對象，探討在損害因素作用下鎂對內(nèi)耳的保護(hù)性機(jī)制，以期為將來感音神經(jīng)性聾的治療提供一些新的策略。本文分四部分。 第一部分螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的無血清培養(yǎng) [目的]用無血清培養(yǎng)的方法體外培養(yǎng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定實(shí)

3、驗(yàn)基礎(chǔ) [方法]采用3d內(nèi)的SD大鼠取螺旋神經(jīng)節(jié)組織，觀察在無血清培養(yǎng)基(高糖DMEM+B27)+阿糖胞苷(cytosinearabinoside，Ara-C)中螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的生長情況，免疫組化鑒定培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。 [結(jié)果]使用高糖DMEM培養(yǎng)基及B27添加劑，聯(lián)合5μMAra-C作用48小時，能有效抑制非神經(jīng)細(xì)胞增值，得到比較純的SGCs。得到的細(xì)胞經(jīng)免疫組化抗神經(jīng)絲蛋白抗體證實(shí)為SGCs。 [結(jié)論]通

4、過無血清培養(yǎng)的方法，獲得的SGCs純度較高，細(xì)胞活性保持良好，可為體外研究螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能狀態(tài)提供細(xì)胞模型。 第二部分谷氨酸對體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷作用 [目的]探討谷氨酸對體外原代培養(yǎng)的大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞興奮性毒性作用。 [方法]SGC在體外培養(yǎng)4天，加入1mmol/L谷氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)24后，用熒光顯微鏡觀察Hoechest33258和PI雙標(biāo)的細(xì)胞形態(tài)改變和用激光共聚焦方法來觀察細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子

5、濃度變化。 [結(jié)果]體外培養(yǎng)4天的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，用1mmol/L谷氨酸處理24h后，與對照組相比，出現(xiàn)大量的細(xì)胞受損，表現(xiàn)為死亡或凋亡，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；用Fluo-3染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)加入谷氨酸后，80％的SGC胞內(nèi)鈣離子迅速增加，180s達(dá)到高峰。 [結(jié)論]谷氨酸誘導(dǎo)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損與鈣離子內(nèi)流有明顯的關(guān)系。 第三部分鎂離子對谷氨酸誘發(fā)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

6、 [目的]探討鎂離子對谷氨酸所致的體外培養(yǎng)的大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞興奮性毒性的保護(hù)作用。 [方法]SGC在體外培養(yǎng)4天，加入1mmol/L谷氨酸和/或lmmol/L氯化鎂后，繼續(xù)培養(yǎng)24后，用激光共聚焦方法來觀察Annexin-V-FITC和PI雙標(biāo)的細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化。 [結(jié)果]體外培養(yǎng)4天的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，用1mmol/L谷氨酸處理24后，出現(xiàn)大量的細(xì)胞受損，表現(xiàn)為死亡或凋亡，預(yù)先用1mm

7、ol/L的MgCl2可明顯提高細(xì)胞的存活率(P＜0.05)；用Fluo-3染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，加入谷氨酸后，80％的SGC胞內(nèi)鈣離子迅速增加，180s達(dá)到高峰；預(yù)先加入MgCl2則可抑制谷氨酸介導(dǎo)的鈣離子反應(yīng)，在整個觀察時段細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯波動。 [結(jié)論]鎂離子可能通過抑制鈣離子內(nèi)流，來降低谷氨酸對體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。 第四部分膳食鎂含量的變化對SD大鼠的噪聲性聾的影響 [目的]研究

8、飼料中不同鎂水平對大鼠在聲損傷中影響，評價鎂在聲損傷中的作用 [方法]SD大鼠24只，隨機(jī)分為2組，飼以人工合成飼料。組1大鼠給予低鎂飼料(鎂100mg/kg)，組2飼料含適量鎂(鎂507mg/kg)，組3為高鎂飼料(鎂1000mg/kg)。20天人工飼料飼養(yǎng)后，開始聲損傷實(shí)驗(yàn)，暴露于倍頻程噪聲(4kHz中心頻率)105dBSPL3h，測試暴露前后聽性腦干反應(yīng)(ABR)的閾值；DPOAE的幅值；血清和外淋巴液中鎂離子濃度和血清總