松質骨-水凝膠支架構建類骨軟骨復合物.pdf

1、軟骨組織結構簡單，無血管神經(jīng)長入，因此自身修復能力有限。傳統(tǒng)的軟骨缺損治療方法各有局限性且不能完全恢復軟骨組織的功能性，因此，利用組織工程方法構建骨軟骨仿生組織復合物是未來解決大面積骨軟骨缺損的最佳方法之一。本實驗采用生物相容性強、與人體骨組織結構及性能相似的豬源骨松質脫脂、脫鈣、脫蛋白后作為骨部分仿生支架，將殼聚糖明膠混合凍干并交聯(lián)后構建殼聚糖-明膠水凝膠支架作為軟骨部分仿生支架。在構建的水凝膠/松質骨支架上分別接種骨細胞軟骨細胞方向

2、誘導分化后的脂肪干細胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCs)后，構建雙層骨軟骨復合物并檢測其用于骨軟骨修復中的可行性。
　　首先，制備骨松質支架，檢測其孔徑分布、孔隙率，掃描電鏡觀察其表面形貌并利用紅外檢測其化學組成。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)骨松質支架表面有大量納米級突起，骨松質支架內孔道連通，支架的平均孔徑為410±59μm，孔隙率為70.64±1.71％。通過紅外檢測發(fā)現(xiàn)，骨松質支架內含有羥基磷灰石與蛋白質等

3、有機物質。制備不同濃度的殼聚糖/明膠水凝膠支架并檢測不同濃度下支架的孔隙率、溶脹率及降解率，選擇綜合性能最優(yōu)的濃度用于制備本實驗所需的水凝膠支架。觀察最佳濃度組水凝膠支架的孔徑、微觀形貌并用紅外檢測分析交聯(lián)前后殼聚糖/明膠的化學組成變化。本研究水凝膠中明膠與殼聚糖的質量比為3∶1，設置3％，4％，5％三組不同濃度的水凝膠。經(jīng)相關物理性能檢測，發(fā)現(xiàn)4％濃度組水凝膠支架的孔隙率、溶脹率及降解率等綜合性能最優(yōu)，最適合作為軟骨仿生支架。4％濃度

4、組水凝膠支架內孔道間相互連通，水凝膠的平均孔徑為117±21μm，孔隙率為83.40±0.79％，溶脹率為362.00±2.38％，PBS浸泡法測得6周后支架剩余重量為起始干重的80.76±1.6％。紅外檢測表明水凝膠支架交聯(lián)后明膠與殼聚糖的官能團發(fā)生了化學反應。骨松質支架與水凝膠支架的各項物理性能與原位骨軟骨組織的物理性能相似。此外，松質骨及殼聚糖/明膠還具有良好的生物相容性。
　　種子細胞采用分離純化后的人ADSCs，體外培養(yǎng)

5、擴增并向脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞誘導分化后，檢測細胞的生長狀況、形態(tài)變化，并用常規(guī)染色檢測分化效果。分離純化后的ADSCs呈長梭形貼壁生長，增殖速度快，5～6天可傳代一次。脂肪培養(yǎng)中誘導培養(yǎng)兩周后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，油紅染色可見細胞內有紅色小油滴。軟骨培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)三周后，甲苯胺藍染色發(fā)現(xiàn)軟骨細胞分泌的多糖類胞外基質被染為淡紫色。骨誘導培養(yǎng)后，實驗組的ALP染色、vonKossa染色及茜素紅染色均呈現(xiàn)陽性，而對照組不被染色或染色不

6、明顯。綜合以上可得，ADSCs擴增速度快、一定代數(shù)范圍內形態(tài)穩(wěn)定，可分化為脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞，適于作為骨軟骨復合物構建的種子細胞。
　　在兩部分支架材料制備及性能檢測與種子細胞擴增及分化能力檢測的基礎上，將種子細胞與支架復合構建骨軟骨復合物。首先將誘導分化后的ADSCs以1×107cells/mL的密度分別接種在骨松質及水凝膠支架上，孔板內分離培養(yǎng)兩周后構建骨軟骨復合物。復合物的構建分為三組:雙層仿生支架復合培養(yǎng)實驗組，

7、分離培養(yǎng)對照組及空白支架組。共培養(yǎng)兩周后，倒置顯微鏡下觀察支架內的細胞生長狀態(tài)，Dead/Live熒光染色觀察細胞在支架上的生長增殖狀態(tài)并用IpWin5軟件分析染色情況及細胞活性，茜素紅染色觀察骨松質支架上的骨向分化能力情況。掃描電鏡觀察實驗組水凝膠支架及骨松質支架上細胞的生長貼附狀態(tài)及胞外基質分泌情況。共培養(yǎng)后，倒置顯微鏡檢查結果表明ADSCs在支架上黏附良好，可見不同尺寸的細胞群落。IpWin5軟件分析Dead/Live熒光染色的光

8、密度及染色面積，t-檢驗檢測顯著性。軟骨支架上實驗組與對照組的累計光密度分別為350059dpi、163129dpi，P＜0.005。骨支架上實驗組與對照組的累計光密度分別為306222dpi、31595dpi，P＜0.005。骨支架上實驗組與對照組細胞的熒光染色面積分別為14815.10μm2、1412.13μm2，P＜0.005。軟骨支架上實驗組與對照組細胞的熒光染色面積分別為16836.96μm2、7829.27μm2，P＜0.0

9、05。復合支架組（實驗組）的細胞熒光染色面積及累計光密度與對照組有顯著性差異，表明實驗組比單層培養(yǎng)對照組的細胞生長增殖能力強。茜素紅染色結果表明實驗組骨松質支架上的染色比對照組深。用掃描電鏡觀察構建的復合物發(fā)現(xiàn)細胞生長在水凝膠及骨松質支架的孔道內，以細胞集簇的方式存在。骨松質支架上可見無機鹽及骨晶等胞外分泌物，水凝膠支架表面亦可見大量分泌物。以上檢測表明，雙層支架構建的骨軟骨復合物比單層仿生支架的構建效果好，因此，本實驗中制備的雙層支架