結直腸癌候選抑癌基因ACVR1C的篩選和鑒定研究.pdf

1、研究目的：利用雜合缺失方法發(fā)現(xiàn)相關位點，對位點附近存在的基因進行篩選發(fā)現(xiàn)候選基因，并對其開展驗證可發(fā)現(xiàn)新的抑癌基因。本課題組前期采用雜合缺失掃描及精細定位候選克隆策略對中國人結直腸癌臨床標本進行全基因組掃描，本研究以此為基礎，針對1、2號染色體高頻雜合缺失區(qū)域開展基因芯片掃描，篩選候選抑癌基因并對其開展驗證，希望發(fā)現(xiàn)新的結直腸癌相關抑癌基因。 方法：第一章以課題組前期實驗結果為基礎，針對1、2號染色體高頻雜合缺失區(qū)域開展基因芯片

2、掃描，然后對篩選出的候選基因采用Real-time PCR進行初步驗證。第二章對芯片篩選出的ACVR1C進行驗證，首先擴大組織樣本量檢測ACVR1C在結直腸癌及其對應正常組織中的表達差異情況，然后構建目的基因過表達慢病毒轉染結腸癌細胞，通過MTT檢測、細胞周期分析、凋亡檢測、平板克隆和軟瓊脂克隆形成實驗、細胞遷移實驗研究ACVR1C對結腸癌惡性生物學行為的影響，最后開展裸鼠皮下成瘤實驗在體內平臺對ACVR1C的抑癌作用進行驗證。

3、 結果：1.基因芯片掃描發(fā)現(xiàn)CSRP1、PPP1R12B、LMOD1、CFHR3與ACVR1C5個表達顯著下調基因，通過生物信息學分析以及Real-time PCR實驗，推測CSRP1基因和ACVR1C基因可能是與結直腸癌發(fā)生相關的抑癌基因。2.針對ACVR1C基因擴大樣本驗證其在mRNA和蛋白水平的表達差異情況，結果顯示部分結直腸癌組織中ACVR1C的表達水平較正常組織降低或缺失。而后制備ACVR1C-wt與ACVRIC-ca過表達慢

4、病毒感染結腸癌RKO細胞，用于研究ACVR1C對結腸癌惡性生物學行為的影響。MTT實驗發(fā)現(xiàn)轉染ACVR1C基因后可抑制RKO細胞的生長，通過細胞周期分析及凋亡檢測，發(fā)現(xiàn)轉染ACVR1C基因后G1期細胞比例及凋亡細胞比例較對照組升高。同時通過平板克隆和軟瓊脂克隆形成實驗檢測ACVR1C對細胞體外成瘤能力的影響，發(fā)現(xiàn)轉染ACVR1C后RKO細胞克隆數(shù)量少于空白細胞及空載體細胞，再次證實轉染ACVR1C后可抑制RKO細胞增殖能力。通過Tran

5、swell遷移實驗發(fā)現(xiàn)，轉染ACVRIC的RKO細胞通過濾膜的數(shù)量明顯少于對照組。最后開展裸鼠皮下成瘤實驗在體內平臺對ACVR1C的抑癌作用進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)轉染目的基因的RKO細胞成瘤體積及重量均明顯小于對照組。 結論：本研究通過基因芯片掃描及Real-time PCR篩選出結直腸癌候選抑癌基因ACVRIC，然后在體內外多個平臺通過分子生物實驗、細胞實驗及動物實驗對ACVR1C進行驗證，推測ACVRIC可能成為一新的結直腸癌相