實驗性單側(cè)前牙反牙合修復(fù)體對大鼠髁突軟骨基質(zhì)及相關(guān)因子表達(dá)的影響研究.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(TMD)是一類常見的口腔疾病。骨關(guān)節(jié)炎是其病理性改變之一,其特征為軟骨基質(zhì)降解,軟骨下骨改建,骨贅形成以及關(guān)節(jié)慢性炎癥。咬合異常是TMD的重要病因之一。本課題組前期研究表明,大鼠后牙漸進(jìn)性咬合紊亂可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)盤增厚,髁突軟骨異常改建,甚至出現(xiàn)退行性變。本研究在此基礎(chǔ)上,以Sprague-Dawley(SD)大鼠為研究對象,首次施加了前牙不良修復(fù)體的操作,建立了實驗性前牙反牙合動物模型,通過化學(xué)染色觀察大鼠髁突軟骨組織形

2、態(tài)學(xué)變化,測量軟骨厚度的改變和蛋白多糖(PG)的變化;通過real-timePCR研究PCNA,COLII,aggrecan,MMP-3,MMP-9,MMP-13以及TIMP-1mRNA水平的表達(dá)變化;通過免疫組織化學(xué)染色方法觀察COLII,MMP-3,MMP-9以及TIMP-1表達(dá)部位,通過計算陽性細(xì)胞百分比來研究軟骨中上述因子的表達(dá)變化,探討前牙反牙合不良修復(fù)體致咬合紊亂對大鼠髁突軟骨細(xì)胞異常增殖,軟骨基質(zhì)降解的影響。
　　選

3、取54只6周齡雌性SD大鼠(由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供),體重140-160g,隨機、等量分為實驗組和對照組,各3個時間點,每組9只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后,實驗組進(jìn)行粘接單側(cè)前牙反牙合不良修復(fù)體的操作,造成實驗性前牙咬合紊亂動物模型,對照組不做任何處理,同樣條件下飼養(yǎng)至實驗結(jié)束。實驗組和對照組分別于實驗開始后第2、4和8周處死動物,取左側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)常規(guī)脫鈣、石蠟包埋,進(jìn)行HE、甲苯胺藍(lán)以及免疫組化染色;取右側(cè)髁突凍存于-80o

4、冰箱以備real-timePCR使用。
　　結(jié)果如下:
　　1.HE染色:對照組髁突軟骨表面光滑連續(xù),細(xì)胞排列整齊,依次分為纖維層、增殖層、肥大層和鈣化軟骨層。實驗組髁突軟骨出現(xiàn)退變,表現(xiàn)為軟骨分層不清,細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞排列紊亂,8周時最為嚴(yán)重,9個關(guān)節(jié)中有3個出現(xiàn)明顯的無細(xì)胞區(qū)。病變區(qū)軟骨細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死,胞核固縮,核染色質(zhì)濃縮,局部出現(xiàn)嗜均質(zhì)染色。
　　2.軟骨厚度變化:與對照組相比,實驗4周時髁突軟骨纖維層中

5、1/3厚度增厚(P<0.05);增殖層中1/3和后1/3厚度均比對照組增厚(P<0.05和P<0.01);實驗8周時肥大層中1/3和后1/3厚度均顯著變薄(P<0.01)。實驗4周時全層后1/3厚度比對照組增厚,其他組別間軟骨厚度無顯著性差異(P>0.05)。
　　3.髁突軟骨細(xì)胞增殖活性及基質(zhì)表達(dá)變化:real-timePCR結(jié)果顯示,2周和4周時,實驗組PCNAmRNA表達(dá)低于對照組(P<0.05),8周時無顯著性差異;4周時

6、,實驗組COLIImRNA表達(dá)低于對照組(P<0.05),2周和8周無顯著性差異;2周時實驗組aggrecanmRNA表達(dá)高于對照組(P<0.05),而4周和8周時,實驗組表達(dá)均低于對照組(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示PCNA主要表達(dá)于髁突軟骨的增殖層,2周和4周時,實驗組PCNA陽性細(xì)胞率低于對照組(P<0.05),8周時無顯著性差異;COLII主要表達(dá)于髁突軟骨增殖層和肥大層,4周和8周時,實驗組COLII染色陽性區(qū)域少于對照組

7、,2周時無顯著性差異。
　　4.甲苯胺藍(lán)染色顯示:對照組軟骨中蛋白多糖表達(dá)均勻一致,主要分布于增殖層和肥大層細(xì)胞外基質(zhì),4周和8周時,實驗組蛋白多糖表達(dá)明顯低于對照組。
　　5.髁突軟骨中MMP-3,MMP-9,MMP-13和TIMP-1表達(dá)變化:real-timePCR結(jié)果顯示,4周和8周時,實驗組MMP-3mRNA表達(dá)均高于對照組(P<0.05),而2周時無顯著性差異;2周時實驗組MMP-9mRNA表達(dá)高于對照組,4周時

8、實驗組低于對照組(P<0.05),8周時無顯著性差異;2周時,實驗組MMP-13和TIMP-1mRNA表達(dá)高于對照組(P<0.05),而4周和8周時,實驗組中二者表達(dá)低于對照組(P<0.05,P<0.01)。免疫組化染色顯示:MMP-3主要表達(dá)于髁突軟骨肥大層,8周時,實驗組MMP-3陽性細(xì)胞率高于對照組(P<0.05),2周和4周時無顯著性差異;MMP-9主要表達(dá)于髁突軟骨肥大層,2周時,實驗組MMP-9陽性細(xì)胞率高于對照組(P<0.

9、05),而4周時實驗組低于對照組(P<0.05),8周時無顯著性差異;TIMP-1主要表達(dá)于髁突軟骨增殖層和肥大層,2周時,實驗組TIMP-1陽性細(xì)胞率明顯高于對照組(P<0.01),4周和8周時,實驗組均低于對照組(P<0.01,P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.實驗性單側(cè)前牙反牙合不良修復(fù)體可以導(dǎo)致大鼠髁突軟骨組織發(fā)生病理性改變,這種組織學(xué)變化程度隨不良修復(fù)體作用時間的延長而更加顯著,并導(dǎo)致髁突軟骨后部肥大層厚度變薄