核干細胞因子RNA干擾對HT29細胞CDX2表達的影響.pdf

1、研究背景及目的
　　 Barrett'食管(BE)是指食管下段復(fù)層鱗狀上皮被化生的單層柱狀所替代的一種病理現(xiàn)象,可伴腸化或無腸化,其中伴有特殊腸上皮化生者屬于食管腺癌的癌前病變。BE是胃食管反流病的并發(fā)癥,約0.5-1％的患者將發(fā)展為食管腺癌。越來越多的研究認為,BE起源于食管粘膜基底層的干細胞,BE細胞來源于干細胞更能解釋BE細胞的分化。在正常生物體的發(fā)育過程中,同源盒基因CDX2對消化道尤其是結(jié)腸和小腸上皮的發(fā)育起著關(guān)鍵的作

2、用,是BE中腸化診斷的非常有用的標志物。核干細胞因子(nucleostemin,NS)存在于干細胞和腫瘤細胞的核仁中,而在已分化的成體細胞中不表達,其參與干細胞和腫瘤細胞的增殖調(diào)控。但NS在BE的發(fā)生、發(fā)展中作用仍不清楚。
　　 在本研究中,我們假設(shè)食管干細胞中NS表達減少可能導(dǎo)致CDX2表達的激活,從而導(dǎo)致干細胞向腸型細胞分化,繼而形成腸化生。而HT29細胞株可以用來作為不同成分的胃十二指腸返流物對BE發(fā)生中細胞和分子事件效應(yīng)

3、研究的體外模型。為了驗證這個假設(shè),我們運用RNAi技術(shù)沉默HT29細胞中NS的表達,了解其對CDX2表達的影響,同時也檢測了鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDC)孵育HT29細胞后NS與CDX2的表達。
　　 研究方法
　　 1、根據(jù)NS基因序列(GeneBank NM_206826),通過www.genscript.com網(wǎng)站在線siRNA設(shè)計工具,設(shè)計三對siRNA,定向插入到質(zhì)粒pRNAT

4、-U6.1/Neo,抽提質(zhì)粒并測序鑒定。構(gòu)建好的三對NS干擾載體分別命名為pRNAi-1,pRNAi-2與pRNAi-3。將細胞種植于6孔板,待細胞融合率達80％～90％時,用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建好的NS干擾載體與空載體轉(zhuǎn)入HT29細胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。
　　 2、采用不同的實驗技術(shù)檢測NS RNAi后HT29細胞增殖能力、細胞周期、克隆形成能力的變化。
　　 3、用100μM、500μM、1

5、000μM的鵝脫氧膽酸孵育HT29細胞,分別于0小時、2小時、12小時、24小時后用胰酶消化收獲細胞,其中0小時為實驗對照組。
　　 4、運用RT-PCR與Western Blot法檢測HT29細胞中NS與CDX2的表達。
　　 結(jié)果
　　 1、測序結(jié)果經(jīng)比對,插入寡核苷酸序列與設(shè)計的靶點序列完全吻合,說明重組載體構(gòu)建成功,經(jīng)過G418篩選和克隆挑選,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株,轉(zhuǎn)染細胞在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。

6、r>　　 2、MTT實驗表明干擾組細胞增殖能力明顯低于HT29組和空載體組;平皿克隆形成實驗表明干擾組單個細胞形成克隆的能力與HT29組和空載體組相比顯著降低;流式細胞生長周期實驗表明,與HT29組和空載體組細胞相比,干擾組G0/G1期細胞比例增加,而S期細胞比例下降。
　　 3、3條siRNA真核表達質(zhì)粒均能有效抑制NS的表達,以pRNAi-1作用效果最為明顯,pRNAi-1組較陰性對照組及未轉(zhuǎn)染組細胞有CDX2的增強表達。

7、
　　 4、CDC孵育HT29細胞后,NS表達降低,CDX2表達增高,且兩者的表達與CDC呈濃度與時間依賴性。CDC孵育HT29細胞在100μM的T2、T12、T24時相點與500μMT2、T12時相點,未見CDX2的增強表達,與對照組T0表達相近,NS的表達也與對照組T0表達相近,濃度為500μM時,T24時相點與1000μM T2、T12、T24時相點CDX2濃度呈逐漸增強表達趨勢,NS的表達則為逐漸下降:尤其是在濃度為10