分子系統(tǒng)學重構(gòu)柑橘重要病原真菌的種類關(guān)系.pdf

1、柑橘（Citrus）是世界性的大宗水果，我國則是世界上第一大柑橘生產(chǎn)國。與其他作物一樣，柑橘真菌性病害種類繁多，始終困擾著柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，而正確鑒定病害的病原菌種類和優(yōu)勢種是開展病害發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)研究的基礎(chǔ)。隨著分子系統(tǒng)學在植物病原真菌分類鑒定中的廣泛運用，過去基于寄主范圍和形態(tài)學特征建立起來的分類階元正面臨著重大的變動，利用形態(tài)學、寄主范圍、生理生化特性和基于多基因系統(tǒng)進化分析相結(jié)合的分類鑒定法已得到廣泛的認同。刺盤孢屬（Co

2、lletotrichum spp.）、間座殼屬（Diaporthe spp.）、球腔菌類（“Mycosphaerella”spp.）和鏈格孢屬（Alternaria spp.）是柑橘上的重要病原真菌，分別引起炭疽病和花后落葉病，黑點病、樹脂病和褐色蒂腐病，脂點黃斑病和鏈格孢褐斑病和黑腐病，這些病害癥狀多變，而國際上對柑橘上的這類病害病原的系統(tǒng)性研究缺乏。本研究較為系統(tǒng)地收集從中國主要柑橘產(chǎn)區(qū)，主要栽培柑橘上的刺盤孢屬、間座殼屬、球腔菌類

3、群和鏈格孢屬真菌，結(jié)合形態(tài)學和基于多基因系統(tǒng)進化分析的方法，對其進行種類鑒定，以期明確這些病害的確切病原種類和優(yōu)勢種，研究結(jié)果報告如下:
　　1.中國柑橘相關(guān)的Colletotrichum屬真菌的種類和優(yōu)勢種
　　從有癥狀和無癥狀的柑橘葉片、枝梢和果實材料（包括少量金橘材料）上，總共收集312株刺盤孢屬（Colletotrichum）真菌菌株。對這些菌株進行形態(tài)學研究，并將其分為4個形態(tài)學組群。從4個形態(tài)學組群中分別選取代表

4、菌株24株，9株，2株和3株，分別擴增多基因序列包括肌動蛋白(ACT)，β-微管蛋白(TUB)，鈣調(diào)蛋白(CAL)，3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），谷氨酰胺合成酶(GS)基因和核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進行系統(tǒng)進化分析。所有來自柑橘的刺盤孢屬的菌株均被歸入到4個復合種中，即Co.gloeosporioides復合種，Co.boninense復合種，Co.acutatum復合種和Co.truncatum復合種。位于Co.gloeosp

5、orioides復合種中的菌株分為兩個種，分別是Co.gloeosporioides和Co.fructicola;來自Co.boninense復合種的菌株同樣分為兩個種，分別是Co.karstii和一個新種Co.citricola;位于Co.acutatum復合種中的菌株代表一個新種Co.citri;位于Co.truncatum復合種中的菌株就是Co.truncatum。Co.gloeosporioides為柑橘上刺盤孢屬真菌最主要的種

6、群，占全部菌株的92％（287株）。
　　2.中國柑橘相關(guān)的Diaporthe屬真菌的種類和優(yōu)勢種
　　本實驗中，總共獲得柑橘致病相關(guān)的間座殼屬（Diaporthe）真菌菌株119株。其中，72株菌株分離自帶有黑點病癥狀的枝梢、葉片和果實，30株菌株分離自帶有褐色蒂腐病的果實，17株來自枯死的柑橘枝干和主干。這些菌株來源地包括陜西、浙江、廣西、福建、廣東、江西、湖南、重慶和上海等柑橘產(chǎn)區(qū)。另外從美國佛羅里達得到Diaport

7、he citri菌株27株。通過形態(tài)學研究和基于四個DNA位點（ITS，TUB，轉(zhuǎn)錄延伸因子基因TEF和CAL）序列的系統(tǒng)進化分析，所有柑橘致病相關(guān)的間座殼屬菌株被歸入到三個類群。Diaporthe citri是其中最主要的類群（88.2％，105株），并將其和美國佛羅里達得到的菌株進行比較。兩個與D.citri不同的類群被描述為新種D.citriasiana和D.citrichinensis。間座殼屬真菌同樣代表植物上內(nèi)生型和腐生型真

8、菌的重要組成部分，但是相對于病原菌的研究來說，我們對它們知之甚少。在后續(xù)的研究中，我們重點分析了58個間座殼屬真菌菌株，其中44個為柑橘上的內(nèi)生型菌株。通過對四個基因位點(ITS，TEF，TUB，組蛋白基因HIS)序列結(jié)合分析，所有菌株被歸入到16個類群中。這些類群包括一些已知的種群，如Diaporthe arecae復合類群，D.citri，D.citriasiana,Dcitrichinensis,D.endophytica,D.e

9、res,D.hongkongensis和D.sojae。另外，有7個類群被描述為新種Diaporthe biconispora，D.biguttulata，D.discoidispora,D.multigutullata,D.ovalispora,D.subclavata和D.unshiuensis。
　　3.中國柑橘相關(guān)的“Mycosphaerella”真菌的種類和優(yōu)勢種
　　從福建、廣東、貴州、湖南、江西、云南、浙江和廣

10、西采集帶有脂斑病、黃斑病、褐色小圓星以及其它癥狀的柑橘葉片和果實材料。從中總共分離到82株球腔菌類真菌，另外，從其它國家得到8株相關(guān)菌株?；谛螒B(tài)學研究和基于多基因的系統(tǒng)進化分析（ITS，ACT，TUB，核糖體大亞基基因LSU，TEF），這些菌株被歸入到6個不同的屬群中，分別是Cercospora，Pallidocercospora，Passalora，Pseudocercospora，Verrucisporota和Zasmidium。

11、所有這些屬群中，只有來自Zasmidium中的真菌培養(yǎng)條件下可以產(chǎn)生分生孢子，所以被選擇與其近似種群進行進一步比較。最后，從柑橘上的Zasmidium屬中界定出4個種群，即來自印度尼西亞的Z.indonesianum，來自中國柑橘果實上的Z.fructicola和Z.fructigenum，以及Z.citri-griseum。Z.citri-griseum具有世界性分布，它不但發(fā)生于柑橘，還發(fā)生于刺槐、桉樹、芭蕉等其它植物上。
　

12、　4.中國柑橘鏈格孢褐斑病菌（Alternaria alternata）的遺傳多樣性
　　在中國，柑橘褐斑病病原菌（Alternaria alternata sensu lato）于2010年首次被報道于云南省。之后，柑橘褐斑病相繼在中國其他省市報道發(fā)生，包括重慶、浙江、湖南、廣東和廣西。從2010到2012，我們從四個橘類品種和一個雜柑品種上總共收集86個鏈格孢菌株。通過致病性實驗證實，這些菌株中85％能夠?qū)﹂雀倘~片致病。基于多

13、聚半乳糖醛酸酶基因（endoPG）部分序列以及結(jié)合該基因和兩個匿名區(qū)段(OPA1-3，OPA2-1)序列進行的系統(tǒng)進化分析證實，來自中國的所有菌株被歸入到已經(jīng)報道的三個柑橘鏈格孢褐斑病病原菌進化支系中的兩個。其中的進化支系3包括來自土耳其和以色列的參考菌株，進化支系1包括來自美國佛羅里達的參考菌株，并沒有來自中國的菌株被歸入進化支系2。另外，24個來自中國湖南、廣東和廣西的菌株被歸入一個新的進化支系，該支系還包括感染草莓和日本梨的交鏈格

14、孢菌株。通過對本實驗結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)中國柑橘鏈格孢褐斑病病原菌遺傳多樣性并不比其他國家和地區(qū)更豐富，推測中國并不一定是鏈格孢褐斑病的起源中心，其起源中心可能發(fā)生在東南亞的一些其他國家。
　　通過對我國柑橘上4類重要病原真菌較為系統(tǒng)的研究，我們發(fā)現(xiàn)柑橘上刺盤孢屬、間座殼屬、球腔菌類群真菌具有不同的程度的種類多樣性，和柑橘上交鏈格孢屬真菌的種內(nèi)變異豐富。利用基于多基因的系統(tǒng)進化分析，可以清楚地將這些真菌不同的種群區(qū)分開來。同時，本研究