應(yīng)用基因芯片技術(shù)行兒童哮喘易感基因分析.pdf

1、[目的]
　　 1.分析5歲以上哮喘患兒與5歲以下哮喘患兒的外周血基因表達(dá)譜差異。
　　 2.分析5歲以上哮喘患兒與正常對照組患兒的外周血基因表達(dá)譜差異。
　　 3.對差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分類，尋找小兒哮喘易感基因。
　　 [方法]
　　 于早晨同一時間對受試者進(jìn)行外周血取樣(3ml)，分離淋巴細(xì)胞，于Trizol中保存。將受試者樣本進(jìn)行分組，實驗組（5歲以上哮喘兒童），對照組一(5歲以下兒

2、童)和對照組二（呼吸系統(tǒng)炎癥的非哮喘兒童）。抽取RNA后進(jìn)行純化、質(zhì)量控制，RNA逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行標(biāo)記以及純化cDNA探針。
　　 我們采用NanoDrop ND-1000來定量RNA總量，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。數(shù)據(jù)雜交采用以下步驟:1.反轉(zhuǎn)錄;2.ds-cNDA標(biāo)記;3.數(shù)據(jù)雜交、洗滌;4.數(shù)據(jù)掃描;5.數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后選取信號值≥50.0的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過GO和Pathway分析差異表達(dá)基因的作用。用

3、聚類分析來可辨識的基因表達(dá)譜。
　　 [結(jié)果]
　　 1.RNA質(zhì)控合格，基因芯片雜交數(shù)據(jù)結(jié)果清晰可靠。差異表達(dá)基因的組間有明顯不同的表達(dá)譜，可以很好的區(qū)分。
　　 2.在實驗組與對照組一的研究中，發(fā)現(xiàn)在29890個基因中，8079個基因存在差異表達(dá)，其中4720個表達(dá)上調(diào)，3359個表達(dá)下調(diào)。將這些具有差異的基因進(jìn)行GO分析后發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)過程中上調(diào)的基因涉及細(xì)胞過程和細(xì)胞分子的各種代謝過程，下調(diào)的基因主要涉及生

4、物細(xì)胞過程、細(xì)胞等結(jié)構(gòu)的發(fā)育、分化。細(xì)胞組分中，上調(diào)的基因主要包括細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié);下調(diào)的基因則主要涉及細(xì)胞外區(qū)的部分。在分子功能GO分析中，上調(diào)的基因主要參與了蛋白質(zhì)、核酸以及水解酶、轉(zhuǎn)移酶的活性;下調(diào)的基因則參與了感受器、結(jié)構(gòu)分子、離子的結(jié)合以及內(nèi)肽酶的活性。差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway通路分析，共發(fā)現(xiàn)了98條通路，其中基因表達(dá)上調(diào)通路有88條，主要包括細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性和免疫系統(tǒng)疾病等方面;
　　 3.在實驗組與對照組二的研

5、究中，發(fā)現(xiàn)1844個基因存在差異表達(dá)，其中941個表達(dá)上調(diào)，903個表達(dá)下調(diào)。將這些具有差異的基因進(jìn)行GO分析后發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)過程中上調(diào)的基因涉及細(xì)胞過程和細(xì)胞分子的各種代謝調(diào)節(jié)過程，下調(diào)的基因主要涉及防御、免疫以及對生物刺激的各種反應(yīng)。細(xì)胞組分中，上調(diào)的基因主要包括細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié);下調(diào)的基因則主要涉及細(xì)胞膜外部分。在分子功能GO分析中，上調(diào)的基因主要參與了蛋白質(zhì)、核酸、轉(zhuǎn)錄的結(jié)合以及轉(zhuǎn)移酶的活性;下調(diào)的基因則參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、感受器、離

6、子的結(jié)合以及各種肽酶的活性。而對差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway通路分析，共發(fā)現(xiàn)了59條通路，其中基因表達(dá)上調(diào)通路有46條，主要包括細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性和免疫系統(tǒng)疾病等方面;
　　 [結(jié)論]
　　 1.實驗組與兩個對照組的基因表達(dá)相比較，均有不同，這些差異基因涉及到多種生物學(xué)過程。這說明兒童哮喘是一個復(fù)雜的病理生理過程。
　　 2.參與兒童哮喘的差異表達(dá)基因，可以作為臨床檢驗的標(biāo)志。
　　 3.基因芯片技術(shù)成