低劑量X射線誘導小鼠骨髓和人外周血紅細胞微核率流式儀自動化檢測的研究.pdf

1、隨著科學技術的進步，射線、微波、電磁輻射等在人類的生活越來越普及，例如醫(yī)療診斷、特殊造影、醫(yī)用治療以及商用輻照等。然而科學技術的進步也給人類社會帶來了許多負面影響，其中最重要的是人類健康問題。輻射線對人類的健康造成了嚴重的威脅，許多人已經(jīng)注意到它對機體遺傳物質的損傷。世界各國對射線、微波、電磁輻射等都有規(guī)范的，統(tǒng)一的評價程序，其中最常用的是染色體畸變(CA)分析和微核實驗(MNT)。CA分析的優(yōu)點在于結果精確，可靠，能夠提供的信息比較豐

2、富，但費時費力，需要進行細胞培養(yǎng)。傳統(tǒng)的微核實驗(MNT)已滿足不了實際工作的需要，依然依賴于人工顯微鏡計數(shù)，主觀性太強；一般要求計數(shù)數(shù)干個細胞，工作量太大且敏感性較低，并能導致一些樣本的漏檢或出現(xiàn)一些假陽性。發(fā)展微核的自動化檢測就成為快速監(jiān)測人群遺傳損傷的重要手段。 近年來隨著流式細胞儀檢測技術不斷的改進與完善，國內(nèi)外很多專家、學者均致力于自動化試驗的研究。1992年瑞典科學家Grawe發(fā)展了一種流式儀小鼠外周血網(wǎng)織紅細胞微核

3、自動檢測技術，1993年我室曹佳發(fā)展并改進了這一技術，使其達到了實用化水平。2003年，我室孫立平建立基于單激光流式細胞儀的大鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的自動化檢測體系；并結合磁式細胞分離技術，成功應用于人鼻咽癌(NPC)放療患者外周血網(wǎng)織紅細胞微核率的檢測，初步嘗試將該方法作為估算累積輻射劑量的生物計量儀使用。 本研究是在我室前期工作基礎上，以小鼠為動物模型，建立了低劑量X射線誘導小鼠骨髓紅細胞微核率流式細胞儀自動化檢測方法。隨后

4、，利用該方法結合新近發(fā)展的磁式細胞分離技術，觀察頭面部癌癥患者接受低劑量X射線治療后外周血網(wǎng)織紅細胞微核率的動態(tài)變化。 研究所得主要結果如下： 1、流式細胞儀檢測低劑量X射線輻照后小鼠骨髓fMNPCE與fMNNCE:經(jīng)過對不同的檢測參數(shù)的分析比較，最終確定以FL1(指示DNA熒光強度)為縱坐標，F(xiàn)SC(指示細胞大小)為橫坐標能夠很好地區(qū)分各個細胞群——總有核細胞(TNC)、嗜多染紅細胞(PCE)、含微核的嗜多染紅細胞(M

5、NPCE)、正染紅細胞(NCE)以及含微核的正染紅細胞(MNNCE)。經(jīng)X射線處理20小時后，一次輻照劑量0.05Gy、0.1Gy和0.4Gy，小鼠骨隨fMNPCE分別是3.01±0.55‰、4.58±±0.83‰和11.12±1.72‰；對于不同的累積劑量0.1Gy、0.15 Gy、0.2 Gy、0.3Gy、0.4Gy、0.8Gy、1.2Gy和1.6Gy，小鼠骨髓fMNPCE分別為4.72±0.95‰、10.26±2.09‰、13.7

6、7±1.66‰、11.77±2.33‰、17.71±2.19‰、16.43±1.33‰、21.85±3.25‰以及22.17±3.48‰；結果顯示出良好的劑量-反應以及時間-效應關系。 2、流式細胞儀檢測結果與人工鏡檢結果的比較：兩種方法檢測的結果均呈現(xiàn)良好的劑量-反應以及時間-效應關系，但流式儀檢測結果略高于人工鏡檢結果，統(tǒng)計分析顯示兩種方法檢測的結果之間沒有顯著差異，并且二者之間具有良好的相關性(R=0.984，P<0.01

7、)。 3、磁式細胞分選術分離富集效果：共對7例健康志愿者及7例頭面部癌癥患者在接受不同累積放療劑量后的外周血中的CD71抗原陽性的網(wǎng)織紅細胞(Trf-Ret)進行了富集分離，結果表明，不同個體間Trf-Ret的產(chǎn)量差異很大，在20％-90％之間，但這并非分離方法所致，而是個體差異造成，如年齡，工作以及接受輻射線劑量大小等。并證實該方法具有簡單、可靠，重復性好的特點。 4、流式細胞儀檢測低劑量X射線輻照后人外周血MN-Tr

8、f-Ret:以FL4(指示RNA熒光)為縱坐標，F(xiàn)SC(指示細胞大小)為橫坐標，將富集后人外周血樣本分成明顯的5個細胞群——網(wǎng)織紅細胞、含微核的網(wǎng)織紅細胞、成熟紅細胞、含微核的成熟紅細胞和有核細胞，利用流式細胞儀成功檢測了頭面部癌癥患者接受低劑量X射線輻照前后外周血MN-Trf-Ret的變化。結果顯示，頭面部癌癥患者接受放療后fMN-Trf-Ret快速顯著增高，隨著累積放療劑量的繼續(xù)增加，fMN-Trf-Ret一直處于高平臺水平。對應于

9、不同的累積放療劑量0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy以及10Gy，fMN-Trf-Ret的平均值分別為2，89±0.93‰、16.2±2.31‰、23.84±3.22‰、32.17±6.95‰、30.89±9.35‰以及35.74±9.95‰。 5、低劑量X射線輻照的曲線擬合方程：在已獲得的fMN-Trf-Ret與累計放療劑量的量效以及時效反應關系基礎上，經(jīng)SPSS13.0擬合的最佳曲線方程為Y=2.595+8.874x-1

10、.005x2+0.044X3(R=0.978，P<0.05)，初步研究認為在0Gy-10Gy劑量范圍內(nèi)，可嘗試利用該方程對輻射事故中的輻射傷員的受照生物劑量進行評估和進一步驗證。 綜上所述，本實驗成功利用流式細胞儀檢測了小鼠在低劑量X射線全身輻照后，觀察到骨髓紅細胞微核率的變化趨勢；并將其用來觀察人在接受低劑量X射線輻照前后外周血網(wǎng)織紅細胞微核率變化情況。結果表明流式細胞儀自動化檢測法在低劑量X射線具有敏感、快速、簡便的特點，為