M3型乙酰膽堿受體功能障礙對內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能及黏著連接的影響和機(jī)制研究.pdf

1、第一部分M3 mAChR 抑制對內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的影響
　　 目的：本文旨在通過觀察M3 型乙酰膽堿受體（mAChR）阻滯對內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的影響，探討M3 mAChR 功能障礙在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和進(jìn)展中的作用。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光組化法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白(VE-cadherin)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在EA.hy926 內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。通過給予M3 mAChR 激動(dòng)劑氯化乙酰膽堿(1×10-

2、6 M)或M3 mAChR 特異性阻斷劑4-DAMP (1×10-6 M)，采用激光共聚焦觀察細(xì)胞Ca 2+熒光強(qiáng)度的變化，驗(yàn)證EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞是否有功能性M3 mAChR表達(dá)。通過給予M3 mAChR 特異性阻斷劑4-DAMP或應(yīng)用siRNA （Small interfering RNA）技術(shù)干預(yù)M3 mAChR，采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖（FITC-葡聚糖）透過Transwell 小室系統(tǒng)來評價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的改變。MT

3、T 法檢測M3 mAChR 阻滯對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響。
　　 結(jié)果：激光共聚焦下β-catenin和VE-cadherin 均勻的分布于細(xì)胞邊緣，表明EA.hy926 內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VE-cadherin和β-catenin ；給予M3 mAChR 激動(dòng)劑氯化乙酰膽堿(1×10-6 M)，Ca 2+熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；當(dāng)用M3 mAChR 特異性阻斷劑4-DAMP (1×10-6M)預(yù)孵育后再給予氯化乙酰膽堿(1×10-6 M)，Ca

4、2+熒光強(qiáng)度無變化；表明EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞有功能性M3 mAChR表達(dá)。與對照組相比，4-DAMP和M3 mAChR siRNA能夠明顯增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性且不伴內(nèi)皮細(xì)胞活性下降。
　　 結(jié)論：M3 mAChR 功能障礙增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性。
　　 第二部分M3 mAChR 抑制對內(nèi)皮細(xì)胞黏著連接蛋白的影響
　　 目的：本文旨在通過觀察M3 mAChR 阻滯對內(nèi)皮細(xì)胞黏著連接蛋白的影響，探討M3 m

5、AChR 功能障礙增加內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的機(jī)制。
　　 方法：通過給予M3 mAChR 特異性阻斷劑4-DAMP或應(yīng)用M3 mAChR siRNA 技術(shù)，采用免疫印跡法測定黏著連接蛋白VE-cadherin和β-catenin的表達(dá)；采用免疫共沉淀和免疫印跡法測定黏著連接蛋白VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平；采用免疫印跡法測定Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin的

6、變化，觀察M3 mAChR抑制對黏著連接蛋白復(fù)合體與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白之間連接的影響。采用免疫熒光組化法檢測VE-cadherin和β-catenin在細(xì)胞邊緣的分布情況。
　　 結(jié)果：M3 mAChR 特異性阻斷劑4-DAMP (1×10-6 M; 0，15，30 min)和M3 mAChRsiRNA 顯著地增加VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平；降低經(jīng)Triton 100-X 不溶部分（與細(xì)胞骨架相連

7、蛋白）中VE-cadherin和β-catenin的表達(dá)；但對VE-cadherin和β-catenin的表達(dá)無影響。4-DAMP (1×10-6 M; 45min)顯著下調(diào)VE-cadherin和β-catenin在細(xì)胞邊緣和細(xì)胞-細(xì)胞連接處的表達(dá)。
　　 結(jié)論：M3 mAChR 抑制通過促進(jìn)黏著連接蛋白酪氨酸磷酸化，下調(diào)其在細(xì)胞邊緣和細(xì)胞-細(xì)胞連接處的表達(dá)，同時(shí)減弱黏著連接蛋白復(fù)合體與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白之間連接，從而使內(nèi)皮細(xì)胞

8、滲透性升高。
　　 第三部分 M3 mAChR 抑制通過降低PTP1B 活性介導(dǎo)黏著連接蛋白酪氨酸磷酸化
　　 目的：本文旨在通過觀察蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)對M3 mAChR 抑制介導(dǎo)黏著連接蛋白酪氨酸磷酸化的影響，探討其中的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：通過給予M3 mAChR 特異性阻斷劑4-DAMP和應(yīng)用PTP1B siRNA 技術(shù)，采用免疫共沉淀和免疫印跡法測定黏著連接蛋白VE-cadherin和

9、β-catenin的酪氨酸磷酸化水平；PTP1B 檢測試劑盒測定PTP1B 活性變化。給予cAMP的類似物8-Br-cAMP （1×10-5M）或PKC α的活化劑PMA （1×10-7 M），研究M3 mAChR 抑制對PTP1B 活性下調(diào)的可能信號機(jī)制。
　　 結(jié)果：PTP1B 特異性siRNA 顯著增加VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平。同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)4-DAMP 介導(dǎo)黏著連接蛋白酪氨酸磷酸化。4

10、-DAMP 降低PTP1B的活性，但對其表達(dá)無影響。8-Br-cAMP（1×10-5M; 10min）對PTP1B 活性無影響，但顯著地抑制4-DAMP 對PTP1B 活性的下調(diào)作用；但是，PMA （1×10-7 M ；10min）對4-DAMP 介導(dǎo)PTP1B 活性下調(diào)無影響。
　　 結(jié)論：M3 mAChR 抑制通過降低PTP1B的活性從而介導(dǎo)黏著連接蛋白酪氨酸磷酸化水平升高。M3 mAChR 抑制介導(dǎo)PTP1B 活性下調(diào)主要

11、是通過信號分子cAMP 而非PKC α。
　　 第四部分IQGAP1 參與M3 mAChR 抑制下調(diào)Rac1 活性介導(dǎo)黏著連接復(fù)合體與細(xì)胞骨架蛋白分離
　　 目的：本文旨在通過觀察M3 mAChR 抑制對Rac1 活性的影響。探討M3 mAChR 抑制減弱黏著連接復(fù)合體與細(xì)胞骨架蛋白之間連接的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)通過給予M3 mAChR 特異性阻斷劑4-DAMP和應(yīng)用IQGAP1 siRNA 技術(shù)，采用

12、免疫印跡法測定Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表達(dá)的變化，觀察IQGAP1 對M3 mAChR 抑制介導(dǎo)黏著連接蛋白復(fù)合體與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白分離的影響。采用pull-down 法檢測M3 mAChR 抑制對Rac1 活性的影響。采用免疫共沉淀和免疫印跡法測定M3 mAChR 抑制對IQGAP1-Rac1 蛋白復(fù)合體與IQGAP1-β-catenin 蛋白復(fù)合體表達(dá)水平的影響。為研究NO是否參

13、與M3 mAChR 抑制介導(dǎo)的黏著連接復(fù)合體與細(xì)胞骨架蛋白之間分離，給予NO 供體SNAP 預(yù)處理，用免疫印跡測定Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin的變化，用pull-down 法測定其對Rac1 活性的影響。
　　 結(jié)果：IQGAP1 特異性siRNA 減少Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表達(dá)；同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)4-DAMP 介導(dǎo)的Trito

14、n 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表達(dá)減少；這些結(jié)果表明，IQGAP1 維持黏著連接復(fù)合體與細(xì)胞骨架蛋白之間的連接并且參與到M3 mAchR 抑制介導(dǎo)它們之間的分離。4-DAMP （1×10-6 M ；0，5，10，15min）降低Rac1 活性，而對Rac1 蛋白表達(dá)無影響。4-DAMP （1×10-6 M）降低Rac1-IQGAP1 復(fù)合體的水平，卻增加IQGAP-β-catenin 復(fù)合體的水平；

15、給予M3 mAChR 激動(dòng)劑，氯化乙酰膽堿（1×10-8 摩爾/升）預(yù)處理，顯著抑制4-DAMP 介導(dǎo)Rac1-IQGAP1 復(fù)合體與IQGAP-β-catenin 復(fù)合體的變化；這些結(jié)果表明抑制M3 mAChR 降低Rac1 活性使IQGAP1與Rac1分離并通過與β-catenin 相結(jié)合從而使VE-cadherin/β-catenin 復(fù)合體與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白分離。NO 供體SNAP 顯著抑制4-DAMP 介導(dǎo)的Rac1 活性下調(diào)

16、和Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表達(dá)減少，但與無干預(yù)組相比均仍有下降；表明M3 mAchR 功能障礙引起NO 減少導(dǎo)致VE-cadherin/β-catenin 復(fù)合體與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白之間的分離以及Rac1 活性的下降,并且這一過程存在NO 非依賴性途徑。
　　 結(jié)論：M3 mAChR 抑制降低Rac1 活性，使IQGAP1與Rac1分離并通過與β-catenin相結(jié)合從而使VE