MSCs移植對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦內(nèi)GDNF、bFGF及IL-6含量影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的： 新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是圍生期窒息引起的新生兒腦損傷，是引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一。HIE的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明，認(rèn)為主要與興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載及細(xì)胞凋亡等原因有關(guān)。目前治療HIE所采用的興奮性氨基酸受體拮抗劑、多種腦細(xì)胞活性藥物，以及功能鍛煉效果均不滿意，不能使壞死的神經(jīng)細(xì)胞再生。因此有必要尋找一種切實(shí)有效的修復(fù)損傷腦組織的治療方法。 間充質(zhì)干細(xì)胞

2、(MSCs)是一種來源于中胚層的多潛能干細(xì)胞，具有自我更新、高度增值，以及多向分化的特性。近年來研究表明，MSCs在體外合適條件下，可定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，并具有在體內(nèi)向腦損傷部位遷移的能力，使得移植MSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷成為可能。目前已有MSCs移植治療成年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病取得一定療效的報(bào)道，但對(duì)于新生兒和未成熟動(dòng)物HIE的研究較少。 MSCs移植治療HIE的機(jī)制尚不清楚。MSCs雖在體外可定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，但研究

3、表明，其移植入腦后只有極少部分分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，能否真正與自體的神經(jīng)細(xì)胞形成化學(xué)突觸未有報(bào)道。另一方面，MSCs可以分泌多種細(xì)胞因子，如GDNF、bFGF、IL—6等，這些細(xì)胞因子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及分化過程中發(fā)揮重要的作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，GDNF、bFGF、IL—6等參與并促進(jìn)了神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)和再生。因此有理由推測，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的功能改善而言，細(xì)胞因子分泌的變化，比移植細(xì)胞的神經(jīng)替代功能更為重要。 本實(shí)驗(yàn)擬研究MSCs

4、移植入新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型后，不同時(shí)段大鼠腦組織內(nèi)GDNF、bFGF、IL—6含量的變化，初步探討MSCs移植治療新生大鼠HIE的機(jī)制，為進(jìn)一步進(jìn)行MSCs移植治療新生兒HIE的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離培養(yǎng)和純化 1、MSCs的分離培養(yǎng)、純化 無菌條件下取4～6周齡健康的SD大鼠的雙側(cè)股骨、脛骨，剪斷股骨、脛骨兩端，用L—DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨

5、髓腔，沖出骨髓于離心管中，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，以1000r/min離心10min，棄上清，再用PBS液洗滌一遍，用含10％胎牛血清的L—DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將其接種于25c㎡培養(yǎng)瓶中，置于37℃5％CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下每日觀察1次，3天后半量換液，去除未貼壁細(xì)胞及雜質(zhì)細(xì)胞，5天后全量換液，以后每3天換液1次，待貼壁細(xì)胞生長接近90％融合時(shí)，用PBS沖洗2次培養(yǎng)瓶以去除含血清培養(yǎng)基。以適量0.

6、25％胰蛋白酶—0.02％EDTA室溫消化，將細(xì)胞懸液按1：2的比例傳代接種。待傳代細(xì)胞生長接近完全融合時(shí)，可繼續(xù)傳代。 2、MSCs的鑒定 MSCs培養(yǎng)至第5代時(shí)，以適量0.25％胰蛋白酶—0.02％EDTA室溫消化，PBS洗2次后制成單細(xì)胞懸液，送流式細(xì)胞儀室檢測CD34、CD45、CD29、CD44、CD105。 二、新生鼠HIE動(dòng)物模型的建立和MSCs移植治療HIE 1、新生鼠HIE動(dòng)物模型的建

7、立 將7日齡新生SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=20)、HIE手術(shù)組(n=20)、PBS對(duì)照組(n=20)、MSCs移植組(n=20)。 除正常對(duì)照組外，其余3組乳鼠用無水乙醚吸入麻醉后，仰臥固定于手術(shù)木板上，75％酒精消毒皮膚，切開頸部正中皮膚，分離出左頸總動(dòng)脈，用5-0絲線結(jié)扎兩端并剪斷血管，縫合皮膚。術(shù)后2小時(shí)，放入37℃水浴密閉透明塑料箱中，通入8％O2及92％ N2的混合氣體，維持2.5h后，送回原環(huán)境中母鼠喂

8、養(yǎng)。正常對(duì)照組放入同樣密閉箱中2.5h，通正常空氣。 2、MSCs移植治療HIE MSCs移植組建立HIE模型后24h，將第5代MSCs(1×106個(gè)活細(xì)胞，100g/ml)經(jīng)尾靜脈移植入乳鼠。PBS對(duì)照組則在相同時(shí)間，將PBS(100g/ml)經(jīng)尾靜脈注入乳鼠。HIE手術(shù)組和正常對(duì)照組均不作處理。 三、大鼠神經(jīng)功能損害測評(píng)及腦組織內(nèi)GDNF、bFGF、IL—6含量的檢測 1、大鼠神經(jīng)功能測評(píng)

9、采用大鼠改良神經(jīng)功能損害評(píng)分(mNSS)，評(píng)估各組HIE大鼠在移植后1d、3d、7d、14d的神經(jīng)功能損害情況，正常對(duì)照組在相應(yīng)日齡完成該評(píng)分。 2、新生鼠HIE模型的鑒定及腦組織勻漿制備 MSCs移植組和PBS對(duì)照組分別在移植后1d、3d、7d、14d，HIE手術(shù)組和正常對(duì)照組則在相應(yīng)日齡，完成大鼠改良神經(jīng)功能損害評(píng)分后，快速處死，取出腦組織，取視交叉后2mm附近的冠狀面腦組織塊，以10％福爾馬林固定，制成病理切片，

10、HE染色。 剩余腦組織制備勻漿，以2000r/min離心10min，收集上清液，—20℃冰箱保存待測。 3、腦組織內(nèi)GDNF、bFGF、IL—6含量的檢測 采用GDNF、bFGF、IL—6的ELISA試劑盒，按說明書逐步操作，最后在酶標(biāo)儀450nm處讀出A值，依照標(biāo)準(zhǔn)含量與A值，建立一元回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)直線，取在標(biāo)準(zhǔn)直線范圍內(nèi)的檢測值。 結(jié)果： 一、MSCs的體外分離培養(yǎng)和純化 1、MSCs

11、的原代培養(yǎng)和傳代 正常SD大鼠骨髓分離出單個(gè)核細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶3天后，可見少量細(xì)胞貼壁，7天可見較多細(xì)胞貼壁，部分克隆性增生，在原代培養(yǎng)約15天左右，細(xì)胞可達(dá)90％以上融合。傳代后細(xì)胞生長增快，3～4天可繼續(xù)傳代，細(xì)胞呈漩渦狀、輻射狀或魚群樣排列。MSCs傳至第5代左右，雜質(zhì)細(xì)胞已基本消失。 2、MSCs的鑒定 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示，第5代MSCs的CD34、CD45陰性，CD29、CD44、CD105陽性。

12、 二、新生鼠HIE模型的鑒定 所有HIE模型鼠在缺氧缺血過程中相繼出現(xiàn)煩躁不安、氣促、發(fā)紺、肌肉顫動(dòng)、全身抖動(dòng)、站立不穩(wěn)、不能翻身，行走時(shí)右后肢拖步、夾尾右旋，復(fù)氧后1h，表現(xiàn)為固定向左側(cè)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。 制作的病理切片表明，顯微鏡下見正常對(duì)照組大腦組織結(jié)構(gòu)層次清晰，細(xì)胞輪廓正常，核居中，核仁清楚。PBS對(duì)照組和HIE手術(shù)組大腦組織破壞嚴(yán)重，以大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬損傷最嚴(yán)重，大量神經(jīng)元核固縮、裂解、壞死，結(jié)構(gòu)紊亂、空泡

13、形成，病灶周圍出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，隨著時(shí)間推移，神經(jīng)元變性壞死趨于穩(wěn)定，增生的膠質(zhì)細(xì)胞增多，大腦皮層、紋狀體、海馬等部位形成膠質(zhì)瘢痕。MSCs移植組的大腦皮層、紋狀體、海馬等部位神經(jīng)元壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生的程度較PBS組和HIE手術(shù)組輕，結(jié)構(gòu)基本正常，無空泡形成。 三、大鼠改良神經(jīng)功能損害評(píng)分 正常對(duì)照組大鼠無神經(jīng)功能損害，其余3組在HIE模型制作后，各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)均有神經(jīng)功能損害。MSCs移植組大鼠在移植后前7天，神經(jīng)功能損

14、害評(píng)分與PBS對(duì)照組和HIE手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)，移植后7d～14d，MSCs移植組神經(jīng)功能損害評(píng)分[5.0±0.707，4.4±1.14]均較PBS對(duì)照組[6.8±1.483，6.4±1.14]和HIE手術(shù)組[7.0±1.0，6.0±0.707]低(P1<0.05，P2<0.05)。 四、MSCs移植對(duì)新生鼠HIE腦內(nèi)GDNF、bFGF、IL—6含量的影響 MSCs移植使HIE新生鼠腦內(nèi)GDNF含量增加。

15、MSCs移植組的GDNF含量3d達(dá)到高峰，之后開始下降，14d仍處于較高水平，GDNF含量于1d(67.95±2.59)、3d(72.84±4.28)、7d(69.5±1.55)、14d(68.23±3.59)均高于PBS對(duì)照組、HIE手術(shù)組和正常對(duì)照組(P<0.05)。 MSCs移植使新生鼠HIE腦內(nèi)bFGF含量明顯升高，1d(5.527±0.2285)、3d(5.577±0.1698)、7d(5.4117±0.1123)、

16、14d(5.3074±0.0313)與PBS組、HIE手術(shù)組及正常對(duì)照組的差異均顯著(P<0.05)，而PBS對(duì)照組及HIE手術(shù)組7d～14d的bFGF含量也較正常對(duì)照組高(P<0.05)。 各組HIE新生鼠腦內(nèi)的IL—6含量均較正常對(duì)照組低，其中PBS對(duì)照組及HIE手術(shù)組的降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而MSCs移植組1d(29.36±1.96)、3d(32.10±2.96)、7d(33.53±4.36)、14d(32.1

17、3±2.97)的IL—6含量比PBS對(duì)照組及HIE手術(shù)組的明顯升高(P<0.05)，與正常對(duì)照組水平相當(dāng)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論： 1、在適宜的體外條件下，可從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)出MSCs，并且在體外可以大量擴(kuò)增、純化MSCs； 2、MSCs經(jīng)尾靜脈移植到缺氧缺血性腦病的新生SD大鼠7-14d后，實(shí)驗(yàn)鼠的神經(jīng)功能有所改善，組織病變程度減輕； 3、MSCs移植使HIE新生鼠腦內(nèi)GDNF、bFG