柑橘綠霉病菌比較基因組及抗DMI殺菌劑機理研究.pdf

1、我國是世界上柑橘種植和消費的主要大國之一，柑橘年產量超過千萬噸。柑橘綠霉病一直以來是困擾柑橘儲藏、運輸和銷售環(huán)節(jié)的主要問題。在我國，每年因綠霉病導致的柑橘產量損失高達百萬噸。目前對柑橘綠霉病的防治手段捉襟見肘，病菌抗藥性產生的速率遠超藥劑更替的速率，對農業(yè)生產安全帶造成了嚴重的威脅。然而，由于對病菌的侵染過程和殺菌劑作用機理缺乏足夠的認識，如何有效提高病害的防治效果，同時減少對環(huán)境的傷害是我們目前所面臨的重大挑戰(zhàn)。本研究在此背景下，通過

2、對柑橘綠霉病菌的全基因組測序，系統(tǒng)了解了病菌的遺傳組成，同時在獲得基因組信息的基礎上，闡明了我國柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑主要菌群的抗性調控機理。研究結果如下:
　　1.柑橘綠霉病菌基因組測序揭示大量次生代謝及細胞壁水解酶等基因家族的丟失
　　通過全基因組測序，我們獲得了約26Mb的柑橘綠霉病菌基因組序列，包含103個scaffold。該基因組共編碼約9，000個蛋白和162個tRNA。重復序列約占整個基因組的1％。通過與其

3、他青霉菌、曲霉菌以及近緣的植物病原真菌比較分析后發(fā)現(xiàn)，柑橘綠霉病菌基因組更為緊湊，編碼相對較少的基因。基因組共線性和蛋白家族進化分析顯示，柑橘綠霉病菌有100多個家族發(fā)生了明顯的縮減，僅有兩個家族發(fā)生了擴增。通過對次生代謝物合成基因簇的預測，我們發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中丟失了大部分毒素合成基因簇的關鍵合成基因，僅保留了一個完整的tryptoquialanine合成基因簇，這一結果解釋了前人研究發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌毒素合成能力較弱的現(xiàn)象，同時也預示

4、毒素跟病菌的致病能力并不相關。通過碳氫化合物代謝相關酶的比較發(fā)現(xiàn)，柑橘綠霉病菌丟失了大量的細胞壁水解酶，這也可能是導致該病菌寄主范圍較窄的原因之一。
　　2.線粒體基因組比較分析顯示柑橘綠霉病菌在進化過程丟失了內含子
　　通過基因組測序數(shù)據(jù)的拼接和實驗驗證，我們得到了柑橘綠霉病菌的全長線粒體基因組，該線粒體基因組大小為28，978bp，平均A+T含量為74.7％，共編碼15個蛋白，27個tRNA，以及兩個核糖體大、小亞基RN

5、A基因。與酵母等物種相比，青霉屬真菌線粒體基因組雖然編碼能力（編碼基因數(shù)）大致相當，但其編碼效率較高（80％為編碼序列）。青霉菌和曲霉菌的線粒體基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，這些菌中線粒體基因組的序列和編碼基因的排列都比較保守，其中atp8基因可能受到負選擇作用。此外，線粒體內含子在所比較的幾個真菌中差異相對較大，而柑橘綠霉病菌在進化過程中可能丟失了一些內含子。
　　3.比較轉錄組揭示柑橘綠霉病菌在碳源利用及PacC調控基因方面的差異

6、>　　通過對柑橘綠霉病菌在柑橘皮和葡萄糖培養(yǎng)基上的轉錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)在柑橘皮培養(yǎng)基上有290個基因發(fā)生了上調表達，而123個基因發(fā)生了下調表達。使用GO數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能注釋后發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與一些代謝過程。此外，很多參與碳源利用的基因都發(fā)生了上調，如木酮糖還原酶，翻轉酶，幾丁質酶，和β-N乙酰己糖胺酶等。相反，參與氨基酸、核苷酸代謝的這些基因大多都沒有發(fā)生差異表達。另外，部分細胞壁水解酶以及tryptoquialan

7、ine的整個合成基因都發(fā)生了上調表達。
　　柑橘綠霉病菌和膠孢炭疽菌都能夠侵染柑橘果實，然而兩者采取截然不同的策略，前者在侵染的時候能夠產生有機酸使環(huán)境酸化，而后者則分泌胺類物質使環(huán)境堿化。通過對這兩個真菌中PacC突變體的表達譜分析后發(fā)現(xiàn)，產酸和產堿真菌中PacC的調控機理已經(jīng)發(fā)生了較為明顯的分化，盡管識別的模體和調控的基因家族相對保守，但是對于特定基因的調控方式（上調或下調）以及表達量差異明顯，產堿真菌中盡管被抑制的基因和被激

8、活的基因數(shù)目相當，但是堿性表達基因在PacC激活情況下表達量有很強的優(yōu)勢。而產酸真菌中，大量的基因在堿性條件下被抑制表達，但當病菌生長過程中，環(huán)境pH不斷降低，這些基因將陸續(xù)被激活，從而參與生長和致病過程。
　　4.PdCYP51B基因的超量表達是造成柑橘綠霉病菌抗DMI殺菌劑的原因
　　在2000年到2010年期間，我們在浙江省主要柑橘產區(qū)收集了403個柑橘綠霉病菌菌株，其中，高達89％的抗性菌株其抗性機理不明。為此，我們

9、比較了不同的抗性和敏感菌株，發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中存在另外兩個相似度較高的CYP51基因，稱之為PdCYP51B和PdCYP51C。進一步分析發(fā)現(xiàn)在未知抗性菌株中，PdCYP51B啟動子區(qū)都含有一段199bp序列的插入，這個特征在抑霉唑敏感菌株和已知抗性基因型的菌株中均不存在。將敏感菌株中的PdCYP51B基因轉入柑橘綠霉病菌后，突變體的抗藥性增加，而將含有199bp序列插入的PdCYP51B基因轉入病菌后，突變體的抗藥性增加更高。說明，1

10、99bp序列的插入造成了PdCYP51B基因的超量表達，從而賦予了病菌對藥劑的抗性。
　　5.199bp插入片段是一個具有轉座和啟動子活性的微小轉座子
　　對上述199bp插入片段進行序列分析，我們發(fā)現(xiàn)了一個TSD(target siteduplication)和一個TIR(terminal invert repeat)位點。此外，該序列無編碼能力，能夠形成穩(wěn)定的二級結構，且富含A+T?；谝陨戏治觯覀冋J為該199bp屬于

11、微小轉座子家族(miniature inverted-repeat transposable element，MITE)，命名為PdMLE1。數(shù)據(jù)庫搜索和Southern雜交顯示,PdMLE1僅存在于柑橘綠霉病菌中，且拷貝數(shù)較多。GFP融合表達顯示，PdMLE1能夠啟動GFP表達，且啟動子能力較強。通過對PdMLE1核心啟動子序列定位，我們得到了一段20bp的啟動子核心區(qū)域，同時我們也通過類似的方法獲得了PdCYP51B基因原始啟動子的