黃鱔生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族的肌肉的克隆與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控及進(jìn)化分析.pdf

1、黃鱔作為“水中人參”，肉質(zhì)細(xì)嫩，鮮美可口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，能夠?qū)崿F(xiàn)人工養(yǎng)殖而日益受到關(guān)注。然而野生黃鱔生長(zhǎng)緩慢，肌肉作為魚類最主要的可食用部分受到多種因素的調(diào)控，生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)對(duì)肌肉的發(fā)生起著重要的調(diào)控作用，本文主要以生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)的表達(dá)作為分子判斷標(biāo)準(zhǔn)，以冰凍切片作為肌纖維形態(tài)觀察的手段，分別從MRFs家族基因的克隆以及種屬特異性分析、不同發(fā)育階段的表達(dá)與形態(tài)觀察、應(yīng)對(duì)肌肉損傷的修復(fù)過(guò)程與機(jī)理、不同濃度大豆?jié)饪s蛋白替代

2、魚粉對(duì)生長(zhǎng)的影響并結(jié)合線粒體基因組，分析黃鱔的種質(zhì)資源情況，以期為黃鱔的規(guī)?；B(yǎng)殖提供技術(shù)支持，并為進(jìn)一步黃鱔的遺傳育種提供遺傳背景支持。本研究主要得到以下結(jié)果:
　　1、采用常規(guī)PCR和RACE技術(shù)成功克隆了黃鱔生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族的全部基因，通過(guò)與NCBI上斑馬魚的序列進(jìn)行比對(duì)，分別命名Myf5、MyoD1，MyoD2、MyoG、MRF4。Genbank登錄號(hào)分別為KM103285、KM103286、KM103287、

3、KM103288和KM103283。比較MRFs家族的基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，這些基因具有相似的結(jié)構(gòu)特征，其結(jié)構(gòu)都是包含一個(gè)位于靠近5'端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，一個(gè)富含堿性氨基酸的區(qū)域，以及一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(basichelix-loop-helix，bHLH)以及一個(gè)染色體激活區(qū)域(CTD)。在所有MRFs成員中，均由65個(gè)氨基酸殘基組成了的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(basic helix-loop-helix，bHLH)保守區(qū)域。蛋白比對(duì)顯示

4、這些基因在物種之間比較保守，而進(jìn)化分析顯示這些基因在進(jìn)化上區(qū)分的很快，其中MRFs家族中的五個(gè)基因首先是分成了兩支:Myf5、MyoD1、MyoD2聚成一支，而MyoG和MRF4另外聚成一支。這與他們?cè)诠δ苌系姆譃閮深愂且恢碌?。另外進(jìn)化分析結(jié)果顯示黃鱔和鱸形目魚類的親緣關(guān)系最近，這對(duì)我們以后克隆黃鱔基因選擇同源物種具有重要意義。
　　2、我們分析了MRFs家族的5個(gè)基因在黃鱔不同發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)特異性和黃鱔在不同發(fā)育階段的肌纖維

5、發(fā)育規(guī)律，同時(shí)也通過(guò)冰凍切片，并運(yùn)用SDH酶染色技術(shù)進(jìn)行探討肌纖維的分布類型以及組成規(guī)律。結(jié)果顯示MRFs在黃鱔肌纖維的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，肌纖維的增粗和增殖與MRFs家族的時(shí)空表達(dá)情況密切相關(guān)。黃鱔肌纖維鑲嵌在不同的結(jié)締組織之間，直徑主要分布在80-200μm之間，隨著黃鱔體重的不斷增加，平均纖維直徑也在不斷的增長(zhǎng)，從5g時(shí)候的平均纖維直徑34±0.47μm到114g時(shí)平均纖維直徑達(dá)到最大153±7.25μm。在黃鱔幼魚中，纖維直

6、徑＜20μm的頻率顯著大于其他階段，并隨著體重的增加，纖維直徑＞60μm的頻率也在增加。另外我們發(fā)現(xiàn)在黃鱔體重＜114g之前，黃鱔肌肉的發(fā)育主要以肌纖維的增粗為主，而超過(guò)114g之后，明顯的觀察到了黃鱔肌纖維的重新生成。
　　3、通過(guò)對(duì)比?；撬嵬段沟狞S鱔和正常飼料投喂黃鱔在面對(duì)鹽酸布比卡因注射損傷時(shí)，生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)的表達(dá)變化情況和相應(yīng)采用冰凍切片技術(shù)分析，肌纖維的恢復(fù)過(guò)程，結(jié)果顯示?；撬釋?duì)肌肉受損的恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用

7、。
　　4、我們探討了不同濃度大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉對(duì)黃鱔幼魚的影響，結(jié)果顯示大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉不超過(guò)48％的情況下不會(huì)影響到黃鱔幼魚的生長(zhǎng)，然而高濃度的大豆?jié)饪s蛋白替代水平會(huì)降低黃鱔幼魚的生長(zhǎng)，消化酶，蛋白酶活性和改變生肌調(diào)節(jié)因子家族的時(shí)空表達(dá)模式。
　　5、我們克隆了來(lái)自貴州、廣西、湖南以及廣東等四個(gè)地方的野生黃鱔線粒體基因組序列，全長(zhǎng)均為16，622bp，并上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得Genbank序列號(hào)KP779622

8、-KP779625。同時(shí)我們比較了4個(gè)不同地域的黃鱔線粒體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)他們和其它硬骨魚類類似，均包含13個(gè)編碼蛋白基因，22個(gè)tRNA基因，2個(gè)rRNA基因以及一個(gè)控制區(qū)。線粒體基因組具有自己的遺傳模式，因此我們比較了4個(gè)不同地域的黃鱔線粒體的密碼子使用特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)黃鱔線粒體基因組中G堿基使用頻率非常低僅為14.45％-14.58％，同時(shí)黃鱔線粒體基因組中具有明顯的偏A堿基和C堿基(AT-skew=0.03，GC-skews=-0.34)。

9、
　　為了評(píng)估黃鱔線粒體的遺傳多樣性，我們分析了四個(gè)不同地域黃鱔線粒體的多態(tài)性，在整個(gè)線粒體的13個(gè)編碼蛋白基因組中，我們共發(fā)現(xiàn)了469個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。占整個(gè)線粒體編碼基因的0.04。在所有的469個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中有266個(gè)位點(diǎn)位于ND1-ND6基因。108個(gè)位點(diǎn)位于CO1-CO3，50個(gè)在ATP8和ATP6基因中發(fā)現(xiàn)，剩下的45個(gè)位于CYTB基因。
　　同時(shí)在黃鱔的13個(gè)編碼蛋白基因中，多態(tài)性最高的為ND5(71)，最低為ND