鉤吻素子抗神經(jīng)病理性疼痛作用與脊髓神經(jīng)活性甾體別孕烯醇酮的關(guān)系.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain,NPP)是由軀體感覺系統(tǒng)損傷或病變引起的疼痛綜合癥,以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏為特征。NPP發(fā)病率高,困擾著數(shù)以千萬計(jì)的患者。NPP疼痛劇烈,藥物治療是其主要治療手段,但目前臨床上治療藥物療效不佳、毒副作用大,亟待研發(fā)具有新治療靶標(biāo)與作用途徑的新型防治藥物。
　　從藥用植物中尋找抗NPP活性成分并深入進(jìn)行相關(guān)的關(guān)鍵科技問題探索研究是創(chuàng)制新型抗NPP藥物的重要途徑。鉤吻(Gel

2、semium elegans Benth)為馬錢科植物胡蔓藤的全草,是歷史悠久的藥用植物。國(guó)產(chǎn)鉤吻的主要有效成分為吲哚類生物堿,其中鉤吻素子(koumine,KM)為其含量最高且毒性較低的一種有效成分,屬于單萜吲哚生物堿,分子式C20H22N2O,分子量為306.3。大小鼠坐骨神經(jīng)慢性束縛損傷(chronic constriction injury,CCI)模型和脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation,SNL)模型為公認(rèn)

3、的經(jīng)典外周NPP動(dòng)物模型。本課題組新近在大鼠CCI模型和大鼠SNL模型上,以熱輻射痛閾、機(jī)械刺激痛閾和自發(fā)性痛行為為指標(biāo),首次觀察到鉤吻素子具有顯著的抗NPP作用,有效劑量遠(yuǎn)低于中毒劑量,因此鉤吻素子可能具有治療NPP的應(yīng)用價(jià)值。
　　然而,鉤吻素子抗NPP作用的機(jī)制有待于探索。外周NPP的發(fā)生機(jī)制包括外周機(jī)制和中樞機(jī)制,其中脊髓背角是外周NPP的重要調(diào)控部位。近年來日益重視神經(jīng)活性甾體在NPP發(fā)生中的調(diào)控作用。別孕烯醇酮(all

4、opregnanolone),又稱3α,5α-四氫孕酮(3α,5α-tetrahydroprogesterone,3α,5α-THP),是一種重要的神經(jīng)活性甾體。有文獻(xiàn)報(bào)道,上調(diào)脊髓3α,5α-THP可產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用,脊髓3α,5α-THP可能是NPP的重要調(diào)控分子。相關(guān)研究資料提示,鉤吻素子抗NPP作用與脊髓3α,5α-THP可能有關(guān),但其關(guān)聯(lián)規(guī)律有待于探索。鑒此,本文擬在大鼠CCI模型上,采用多學(xué)科技術(shù)手段,探討鉤吻素子抗NPP

5、作用與其調(diào)控脊髓別孕烯醇酮水平的關(guān)系,探求其作用的關(guān)鍵效應(yīng)分子;進(jìn)而深入探索鉤吻素子抗NPP作用與其調(diào)節(jié)脊髓別孕烯醇酮合成關(guān)鍵酶3α-羥化類固醇脫氫酶的關(guān)聯(lián)規(guī)律,明確其作用的靶標(biāo),以期闡釋鉤吻素子抗NPP作用的脊髓分子機(jī)制,為防治NPP新藥研發(fā)提供新的藥物作用靶點(diǎn)與作用途徑,并有助于深化理解NPP的中樞機(jī)制;也為提出鉤吻素子抗NPP新功效奠定理論基礎(chǔ)。
　　具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.鉤吻素子抗CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用

6、。
　　在大鼠坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎損傷(Chronic constriction injury,CCI)所致的神經(jīng)病理性疼痛模型上,探討鉤吻素子對(duì)CCI大鼠熱輻射痛閾和機(jī)械刺激痛閾的影響。將基礎(chǔ)痛域閾合格的動(dòng)物隨機(jī)分成假手術(shù)(Sham),CCI模型組,CCI+鉤吻素子(7mg·kg-1、1.4mg·kg-1和0.28mg·kg-1)三3個(gè)劑量組及CCI+加巴噴丁(40mg·kg-1)組。分別測(cè)定大鼠左右兩側(cè)足底對(duì)熱輻射和機(jī)械刺激的縮足

7、反應(yīng)時(shí)間(TWL和MWL),術(shù)后測(cè)定時(shí)間為術(shù)后第3天,、第5天,、第7天,、第9天。術(shù)后第3天開始,假手術(shù)組和CCI模型組大鼠皮下注射生理鹽水,CCI大鼠給藥組大鼠皮下注射對(duì)應(yīng)藥物,每天2次,連續(xù)7天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鉤吻素子具有顯著的抗CCI大鼠熱輻射痛敏與機(jī)械刺激痛覺超敏的作用,鎮(zhèn)痛效應(yīng)呈劑量和時(shí)間依賴性;鉤吻素子(7mg·kg-1)給藥2天即可顯示鎮(zhèn)痛作用,并且在給藥后第7天達(dá)到最大鎮(zhèn)痛作用(％抑制率:熱輻射痛抑制率86.2±2.0

8、%和機(jī)械刺激痛抑制率81.7±2.3%)。結(jié)果提示鉤吻素子具有較強(qiáng)的抗NPP作用。
　　2.鉤吻素子慢性給藥對(duì)CCI所致神經(jīng)痛大鼠脊髓腰段脊髓別孕烯醇酮水平的影響。
　　在大鼠CCI術(shù)后神經(jīng)病理性疼痛模型基礎(chǔ)上,鉤吻素子治療連續(xù)給藥7天后,觀察大鼠脊髓腰段(L5-6)別孕烯酮醇(3α,5α-THP)變化。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組(Sham)、CCI模型組和CCI+鉤吻素子(7mg·kg-1、1.4mg·kg-1和0.28mg·k

9、g-1)三3個(gè)劑量組。結(jié)果顯示鉤吻素子發(fā)揮顯著的抗神經(jīng)病理性疼痛效應(yīng)同時(shí),可顯著提高CCI模型大鼠腰段脊髓別孕烯醇酮的水平,作用呈劑量依賴性,表明鉤吻素子抗NPP神經(jīng)病理性疼痛作用與其提高腰段脊髓內(nèi)神經(jīng)活性甾體別孕烯醇酮的水平有關(guān),提示后者可能是鉤吻素子抗NPP作用相關(guān)的關(guān)鍵效應(yīng)分子。
　　上述研究表明,鉤吻素子能治療CCI所致的外周神經(jīng)病理性疼痛,并且能夠劑量依賴地提高CCI大鼠腰段脊髓別孕烯醇酮的水平。別孕烯醇酮合成關(guān)鍵酶3α

10、-羥化類固醇脫氫酶(3α-HSD)催化5α-二氫孕酮直接生成3α,5α-四氫孕酮。為了明確鉤吻素子提高CCI大鼠腰段脊髓別孕烯醇酮的機(jī)制,下述從脊髓3α-HSD結(jié)構(gòu)(酶表達(dá))與功能(酶活性)角度,深入探討鉤吻素子抗NPP作用與其調(diào)節(jié)脊髓背角3α-HSD的可能關(guān)聯(lián)規(guī)律。
　　3.鉤吻素子對(duì)CCI大鼠術(shù)后神經(jīng)病理性疼痛過程中脊髓背角3α-HSD酶表達(dá)的影響。
　　通過熒光免疫組化技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察CCI大鼠鉤吻素子治療后3α-HSD酶

11、脊髓表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Nave)、假手術(shù)組(Sham)、CCI模型組、CCI+鉤吻素子高劑量(7mg·kg-1)組、CCI+鉤吻素子低劑量(0.28mg·kg-1)組。各組動(dòng)物(除Naive組)于術(shù)后第3天開始給藥,給藥體積給藥體積為0.25mL/100g,Sham組、CCI組每天2次皮下注射生理鹽水;CCI+鉤吻素子高劑量(7mg·kg-1)組、CCI+鉤吻素子低劑量(0.28mg·kg-1)組每天2次皮下注射鉤

12、吻素子。各組分別于術(shù)后第4天、第6天、第9天上午給藥后1h以及術(shù)后第13天大鼠斷頭處死,取腰5-6段脊髓進(jìn)行3α-HSD酶熒光免疫組化。結(jié)果顯示,CCI組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角3α-HSD酶熒光染色強(qiáng)度在術(shù)后有逐天上升的趨勢(shì),術(shù)后第6、9和13天其3α-HSD酶熒光免疫染色顯著增強(qiáng);CCI術(shù)后第9天(給藥第7天),鉤吻素子可顯著增強(qiáng)CCI大鼠脊髓背角3α-HSD酶熒光免疫染色強(qiáng)度,作用隨劑量增大而增強(qiáng)。3α-HSD酶在脊髓背角分布廣泛,可在神

13、經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)分布。
　　4.鉤吻素子對(duì)CCI大鼠術(shù)后神經(jīng)病理性疼痛過程中脊髓背角3α-HSD酶基因表達(dá)的影響。
　　采取Realtime-PCR方法動(dòng)態(tài)研究CCI大鼠術(shù)后鉤吻素子治療后腰段脊髓3α-HSDmRNA表達(dá)水平隨術(shù)后時(shí)間的變化情況。同上分組,實(shí)施藥物干預(yù)、取材;提取脊髓RNA,測(cè)定RNA的完整性和濃度;采用Realtime-PCR研究鉤吻素子對(duì)CCI大鼠腰段脊髓別孕烯醇酮合成酶3α-HSDmR

14、NA水平的影響。結(jié)果表明,CCI組大鼠脊髓內(nèi)3α-HSDmRNA水平在術(shù)后有逐天上升的趨勢(shì),術(shù)后第6、9和13天其水平顯著上升;術(shù)后第9、13天,鉤吻素子可顯著提高CCI大鼠脊髓內(nèi)3α-HSDmRNA水平,作用隨劑量增大而增強(qiáng)。上述結(jié)果提示,鉤吻素子可能通過增強(qiáng)CCI大鼠腰段脊髓3α-HSDmRNA表達(dá)從而提高3α-HSD酶蛋白的水平。
　　5.鉤吻素子對(duì)CCI大鼠術(shù)后神經(jīng)病理性疼痛過程中脊髓3α-HSD酶活性的影響。
　　

15、利用3α-HSD酶動(dòng)力學(xué)法,觀察鉤吻素子對(duì)CCI大鼠術(shù)后神經(jīng)病理性疼痛過程中脊髓3α-HSD酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(na?ve)、假手術(shù)組(sham)、CCI模型組、CCI+鉤吻素子7mg·kg-1和0.28mg·kg-1劑量組。術(shù)后第3天開始,假手術(shù)組和CCI模型組大鼠皮下注射生理鹽水,給藥組大鼠皮下注射對(duì)應(yīng)劑量的鉤吻素子,每天2次,連續(xù)7天。于第7天給藥后1h,大鼠斷頭迅速取出腰5-6段脊髓,在組織酶液提取后進(jìn)行酶活性分析

16、。結(jié)果表明,CCI模型大鼠3α-HSD酶活性顯著提高,鉤吻素子可顯著提高CCI大鼠脊髓內(nèi)3α-HSD酶活性,作用隨劑量增大而增強(qiáng)。
　　6.醋酸甲羥孕酮(MPA)對(duì)鉤吻素子抗CCI大鼠術(shù)后機(jī)械痛敏作用的影響。
　　在CCI大鼠模型上,觀察脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射3α,5α-四氫孕酮合成關(guān)鍵酶3α-羥化類固醇脫氫酶的抑制劑醋酸甲羥孕酮(MPA)對(duì)鉤吻素子抗神經(jīng)病理性疼痛作用的影響。大鼠行蛛網(wǎng)膜下腔置管術(shù),術(shù)后2-3天蛛網(wǎng)膜下腔注射利

17、多卡因鑒定置管術(shù)是否成功。置管術(shù)成功的大鼠恢復(fù)適應(yīng)后,進(jìn)行CCI手術(shù)。以機(jī)械刺激痛閾為指標(biāo)篩選CCI痛敏大鼠。將CCI痛敏大鼠隨機(jī)分為DMSO+NS組、MPA(1.25mg·kg-1)+NS組、DMSO+KM組、MPA(0.25mg·kg-1)+KM組、MPA(0.5mg·kg-1)+KM組和MPA(1.25mg·kg-1)+KM組。CCI術(shù)后第9天,不同組分別蛛網(wǎng)膜下腔注射溶媒DMSO或不同劑量MPA,0.5h后皮下注射鉤吻素子(7m

18、g·kg-1)或生理鹽水,再過1小時(shí)測(cè)量大鼠機(jī)械刺激縮足潛伏期。結(jié)果顯示,外周皮下注射給予鉤吻素子可顯著對(duì)抗CCI大鼠機(jī)械刺激痛覺超敏,而脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射給予MPA可劑量依賴性翻轉(zhuǎn)外周皮下注射給予鉤吻素子的抗CCI大鼠機(jī)械刺激痛覺超敏的作用,但脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射MPA本身對(duì)CCI大鼠機(jī)械刺激痛覺超敏作用沒有顯著影響,提示鉤吻素子抗神經(jīng)病理性疼痛作用可能與其上調(diào)脊髓3α-羥化類固醇脫氫酶酶活性有關(guān)。
　　綜上,鉤吻素子可能通過增強(qiáng)