基因突變與基因多態(tài)性在異基因造血干細(xì)胞移植后白血病復(fù)發(fā)中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植(Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation，allo-HSCT)是血液系統(tǒng)惡性疾病、部分免疫缺陷性疾病、遺傳性疾病、代謝性疾病、及部分實(shí)體瘤的重要治療手段，但是移植后疾病復(fù)發(fā)是導(dǎo)致移植病患死亡的首要原因。盡管過(guò)去30年allo-HSCT治療技術(shù)已取得令人矚目的進(jìn)步，但對(duì)如何減少allo-HSCT后疾病復(fù)發(fā)及提高復(fù)發(fā)患者生存率仍進(jìn)展甚微，原因在于allo-HS

2、CT后白血病復(fù)發(fā)的確切分子機(jī)制迄今不明。本研究從白血病自身生物學(xué)特性與機(jī)體抗白血病免疫的內(nèi)外調(diào)控機(jī)制，圍繞急性白血病allo-HSCT后復(fù)發(fā)機(jī)制開展研究。
　　第1章異基因造血干細(xì)胞移植后供者細(xì)胞來(lái)源的白血病復(fù)發(fā)機(jī)制研究
　　Allo-HSCT后白血病復(fù)發(fā)分為兩大類，一類復(fù)發(fā)的白血病細(xì)胞來(lái)源于正常的供者細(xì)胞，稱為供者細(xì)胞白血?。―onor Cell Leukemia， DCL），DCL是移植后較為少見(jiàn)的復(fù)發(fā)形式，發(fā)生率為0.

3、13％-5％，DCL確切機(jī)制仍不明確，正常供者造血干/祖細(xì)胞的癌基因轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是DCL發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)DCL研究正常的供者干細(xì)胞如何在患者體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒园籽〖?xì)胞，亦是研究白血病發(fā)病機(jī)制的獨(dú)特生物學(xué)模型。
　　本研究設(shè)想在DCL病理過(guò)程中存在腫瘤“二次打擊”模型，通過(guò)對(duì)臨床發(fā)生移植后DCL患者的一系列動(dòng)態(tài)標(biāo)本，包括患者白血病初診骨髓標(biāo)本、化療后完全緩解骨髓標(biāo)本、移植前持續(xù)緩解期骨髓標(biāo)本、移植后第1個(gè)月、第9個(gè)月、第12個(gè)月骨髓

4、標(biāo)本、移植后發(fā)生DCL時(shí)骨髓標(biāo)本和患者口腔粘膜標(biāo)本，以及其健康供者骨髓、外周血和口腔粘膜標(biāo)本，檢測(cè)是否動(dòng)態(tài)發(fā)生目前已明確的、在白血病發(fā)生機(jī)制中起關(guān)鍵作用的兩種類型基因突變:Ⅰ類突變包括FMS樣酪氨酸激酶3基因（Fms-related Tyrosine Kinase3 Gene， FLT3），成神經(jīng)細(xì)胞瘤RAS病毒致癌基因（Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog Gene， NRAS），Ⅱ類突變包

5、括轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α基因(CCAAT Enhancer-binding Protein Gene，CEBPA)，髓系-淋系或混合系白血病基因(Myeloid-lymphoid or Mixed-lineageLeukemia Gene， MLL)，核磷蛋白基因(Nucleophosmin Gene， NPM1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康供者的造血干細(xì)胞帶有CEBPA基因家族性突變(584_589dup)（“一次打擊”），但未引起白

6、血病;敏感的供者干細(xì)胞在特殊的患者體內(nèi)環(huán)境中獲得了CEBPA基因的另外2個(gè)位點(diǎn)突變（247dupC和914_916dup）（“二次打擊”），最終惡性克隆轉(zhuǎn)化成白血病細(xì)胞。本研究首次證實(shí)在移植后供者細(xì)胞來(lái)源的白血病復(fù)發(fā)中存在供者正常干/祖細(xì)胞動(dòng)態(tài)獲得關(guān)鍵功能基因—CEBPA基因多點(diǎn)突變，從而發(fā)生惡性克隆轉(zhuǎn)化為白血病細(xì)胞，首次揭示allo-HSCT后供者細(xì)胞來(lái)源的白血病復(fù)發(fā)中存在多重基因突變打擊機(jī)制，前期研究結(jié)果已以第一作者發(fā)表在血液學(xué)專業(yè)

7、頂級(jí)期刊Blood雜志(IF9.898)。
　　第2章CEBPA基因多點(diǎn)突變致急性白血病發(fā)生的分子機(jī)制研究
　　為進(jìn)一步明確CEBPA基因多點(diǎn)突變致急性白血病發(fā)生的分子機(jī)制，在本部分研究中，我們對(duì)第一部分研究中發(fā)現(xiàn)的CEBPA基因3個(gè)位點(diǎn)的突變:N'端家族性突變（584_589dup，影響蛋白TAD2功能區(qū)）、N'端移碼突變（247dupC，導(dǎo)致正常42KDa全長(zhǎng)蛋白翻譯提前終止，過(guò)度合成缺乏TAD1功能區(qū)的截短30KDa蛋

8、白異構(gòu)體）、和C'端突變（914_916dup，影響蛋白bZIP功能區(qū)），利用慢病毒質(zhì)粒載體(pLenti6.3/V5-DEST)構(gòu)建3種突變及CEBPA基因野生型的慢病毒質(zhì)粒。將CEBPA基因野生型和各個(gè)突變體轉(zhuǎn)染4種急性髓系白血病細(xì)胞株(K562，NB4，Kasum-1， HL60)，小鼠正常髓母細(xì)胞株(32Dc13)，觀察CEBPA基因不同類型突變對(duì)C/EBPα蛋白的抗白血病作用、細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)粒系分化等三大重要功能的影響。結(jié)

9、果發(fā)現(xiàn):CEBPA基因N'端移碼突變(247dupC)產(chǎn)生的截短的C/EBPα-30KDa蛋白具有Ⅰ類突變的作用，使細(xì)胞凋亡障礙，賦予細(xì)胞無(wú)限增殖的能力。影響TAD2功能區(qū)的CEBPA基因N'端家族性突變(584_589dup)影響C/EBPα蛋白的周期阻滯功能。CEBPA基因C'端突變對(duì)C/EBPα蛋白抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和促進(jìn)分化的功能均有損害，可能同時(shí)具有Ⅰ類和Ⅱ類突變的作用。我們的結(jié)果提示CEBPA基因不同位點(diǎn)突變?cè)诎籽“l(fā)生的病

10、理過(guò)程中，分別發(fā)揮Ⅰ類突變和Ⅱ類突變的作用。
　　第3章異基因造血干細(xì)胞移植后患者自身細(xì)胞來(lái)源的白血病復(fù)發(fā)的基因分子機(jī)制研究
　　基于90％以上allo-HSCT后復(fù)發(fā)的白血病細(xì)胞仍來(lái)源于患者自身細(xì)胞，雖然對(duì)這類復(fù)發(fā)普遍認(rèn)為是患者殘留放/化療耐藥白血病細(xì)胞克隆所致，但是越來(lái)越多研究證實(shí)白血病化療后復(fù)發(fā)時(shí)，雖然復(fù)發(fā)的惡性細(xì)胞克隆與初發(fā)克隆具有某些相同的、來(lái)自更早期的前體細(xì)胞克隆起源，但是從初發(fā)到復(fù)發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生了不同的基因突變，

11、絕大部分復(fù)發(fā)克隆是由正常前體細(xì)胞或初發(fā)白血病細(xì)胞進(jìn)一步獲得新的基因突變后演變而來(lái)，少部分復(fù)發(fā)克隆則與初發(fā)克隆具有完全不同的基因背景，從初發(fā)到復(fù)發(fā)過(guò)程中白血病細(xì)胞克隆發(fā)生了克隆演變。
　　因此我們?cè)O(shè)想在allo-HSCT后患者自身細(xì)胞來(lái)源的白血病復(fù)發(fā)中除了體內(nèi)殘留耐藥白血病細(xì)胞克隆外，復(fù)發(fā)克隆亦可能是由初發(fā)白血病細(xì)胞或患者正常細(xì)胞獲得新的基因突變成為優(yōu)勢(shì)克隆演變而來(lái)。在本部分研究中，我們?yōu)榘l(fā)現(xiàn)與成人急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋcute L

12、ymphoblastic Leukemia， ALL）移植后復(fù)發(fā)相關(guān)的基因突變和明確在成人ALL從初診到移植后復(fù)發(fā)過(guò)程中是否存在白血病細(xì)胞克隆演變，選擇臨床最常見(jiàn)ALL類型—ph-、正常核型的前體B細(xì)胞型ALL，首次利用全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)，在全基因組范圍內(nèi)對(duì)患者初診白血病細(xì)胞、移植前處于化療后完全緩解期的血液細(xì)胞和allo-HSCT后發(fā)生復(fù)發(fā)時(shí)的白血病細(xì)胞進(jìn)行基因背景比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)ALL從初診到allo-HSCT后復(fù)發(fā)過(guò)程中存在3種

13、白血病細(xì)胞克隆演變模式，第一種模式中，患者移植后復(fù)發(fā)的白血病細(xì)胞與初發(fā)白血病細(xì)胞具有完全相同的基因背景，復(fù)發(fā)克隆來(lái)自原發(fā)克隆，是原發(fā)克隆的再活化。第二種模式中，患者移植后復(fù)發(fā)的白血病細(xì)胞與初發(fā)白血病細(xì)胞具有某些相同的基因背景，可能起源于初發(fā)克隆中少數(shù)克隆或亞克隆，進(jìn)一步獲得新的基因突變而成為優(yōu)勢(shì)克隆。第三種模式中，患者移植后復(fù)發(fā)的白血病細(xì)胞與初發(fā)白血病細(xì)胞具有完全不同的基因背景，可能是由正常干/祖細(xì)胞獲得特異性基因突變后產(chǎn)生的新的、惡性

14、克隆。
　　我們進(jìn)一步將通過(guò)全基因組外顯子測(cè)序獲得的、可能與ALL移植后復(fù)發(fā)相關(guān)的25個(gè)基因突變位點(diǎn)所涉及的23個(gè)基因，在驗(yàn)證組患者標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，并結(jié)合生物信息學(xué)、基因功能分析，篩選出與Ph-、正常核型前體B細(xì)胞型ALL發(fā)生allo-HSCT后復(fù)發(fā)相關(guān)的PTPN21基因突變。
　　第4章異基因造血干細(xì)胞移植后白血病復(fù)發(fā)的免疫逃逸機(jī)制研究
　　異基因造血干細(xì)胞移植不同于化療的獨(dú)特機(jī)制在于移植后的GVL效應(yīng)，通過(guò)異體細(xì)胞

15、免疫反應(yīng)清除殘留白血病細(xì)胞，是最終治愈白血病的關(guān)鍵，但是，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)的白血病細(xì)胞是如何逃逸GVL效應(yīng)，其免疫逃逸機(jī)制目前仍不明確。在本部分研究中，我們?yōu)榘l(fā)現(xiàn)影響移植后GVL效應(yīng)的關(guān)鍵分子，首次基于中國(guó)人群遺傳背景，圍繞一系列參與GVL免疫反應(yīng)各個(gè)重要環(huán)節(jié)的分子，在中心接受allo-HSCT的白血病患者及其干細(xì)胞供者中開展這些參與GVL反應(yīng)的重要分子包括:細(xì)胞因子—腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-alpha，

16、TNFα）及其受體、干擾素γ（Interferon-γ， IFNγ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TransformingGrowth Factor-β，TGFβ）及其受體、白介素-10(Interleukin， IL-10);免疫細(xì)胞受體—NK細(xì)胞表面重要激活型受體NKG2D（Natural Killer Group2， Member D）和T細(xì)胞表面最重要的共刺激分子—CD28，可誘導(dǎo)共刺激分子(Inducible Co-stimulator，

17、ICOS)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen4，CTLA-4);免疫效應(yīng)分子—粒酶B(Granzyme B)、死亡受體Fas及其配體;天然免疫相關(guān)基因—Toll樣受體（TLR1，TLR2，TLR3，TLR8，TLR9）等的基因型與移植后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系研究，在這些眾多的、參與移植后免疫反應(yīng)各個(gè)重要環(huán)節(jié)的分子中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞供者CTLA-4和NKG2D的基因型、急性髓系白血病(Acute M

18、yeloid Leukemia，AML)患者的Fas基因型顯著影響移植后白血病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，首次報(bào)道接受干細(xì)胞供者為CTLA-4高表達(dá)基因型的患者或干細(xì)胞供者為NKG2D低表達(dá)基因型的患者，及Fas基因-670位點(diǎn)為TT基因型的AML患者，移植后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，結(jié)果提示NKG2D、CTLA-4和Fas的表達(dá)高低影響allo-HSCT后異體反應(yīng)性免疫活性細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷敏感性，為闡明白血病移植后復(fù)發(fā)的免疫逃逸機(jī)制找到關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究結(jié)果

19、已以第一作者發(fā)表在國(guó)際造血干細(xì)胞移植權(quán)威期刊《Haematologica》(IF6.424)、《Bone Marrow Transplantation》(IF3.746)和《Biology of Blood andMarrow Transplantation》(IF3.873)。
　　結(jié)語(yǔ):
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于:
　　(1)在理論上，首次揭示allo-HSCT后供者細(xì)胞來(lái)源的白血病復(fù)發(fā)中存在多重基因突變打擊機(jī)制，首

20、次證實(shí)供者正常干/祖細(xì)胞動(dòng)態(tài)獲得關(guān)鍵功能基因—CEBPA基因多點(diǎn)突變，發(fā)生惡性克隆轉(zhuǎn)化為白血病細(xì)胞。
　　(2)首次關(guān)注CEBPA基因不同類型突變對(duì)C/EBPα蛋白的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)粒系分化功能的影響。
　　(3)對(duì)占allo-HSCT后白血病復(fù)發(fā)90％以上的患者自身細(xì)胞來(lái)源的復(fù)發(fā)，首次提出并證實(shí)存在關(guān)鍵性基因突變和白血病細(xì)胞克隆演變的創(chuàng)新性理論，并篩選出與成人急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生移植后復(fù)發(fā)相關(guān)的PTPN2