miR-125a通過(guò)靶向MMP11和VEGF抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(肝癌)是肝臟中首要的惡性腫瘤。在全球惡性腫瘤死亡率排行榜中,肝癌排名第三。在很多國(guó)家,肝癌的發(fā)病率和死亡率仍在不斷升高。由于早期診斷困難,缺乏有效的治療措施,肝癌患者總體預(yù)后很差。近年來(lái),一些重要的信號(hào)通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用得以闡明,多蛋白激酶抑制劑—索拉菲尼也已經(jīng)被批準(zhǔn)用于肝癌的治療。然而,肝癌早期診斷難,晚期治療效果差的現(xiàn)狀仍然沒(méi)有被改變。因此,深入理解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的診治靶點(diǎn)迫在眉睫。microRN

2、A是一類長(zhǎng)度為17~25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼 RNA。大量研究表明, microRNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。我們對(duì)肝癌相關(guān)microRNA的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索和分析,發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)研究小組都采用microRNA芯片比較肝癌組織和癌旁組織中microRNA表達(dá)差異。這兩個(gè)研究小組的結(jié)果都表明,miR-125a在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。然而miR-125a在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制卻未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的：
　　1.驗(yàn)證

3、miR-125a在肝癌和癌旁組織中的差異表達(dá),并探討miR-125a表達(dá)水平與患者臨床病理資料的相關(guān)性;
　　2.明確miR-125a對(duì)肝癌的惡性表型的調(diào)控作用;
　　3.闡明miR-125a抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-125a在80例肝癌及癌旁組織的表達(dá)情況,并分析其表達(dá)水平和患者臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系;2.構(gòu)建miR-125a的慢病毒載體,感染細(xì)胞,建立

4、穩(wěn)定表達(dá)miR-125a和對(duì)照microRNA的肝癌細(xì)胞系。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)以及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-125a對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響;3.通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)以及裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-125a對(duì)肝癌細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)移的影響;4.運(yùn)用MTT和Transwell實(shí)驗(yàn),采用miR-125a的抑制劑,檢測(cè)下調(diào)內(nèi)源性miR-125a對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響;5.采用target gene以及 microrn

5、a文庫(kù)等生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-125a可能作用的靶基因,并采用雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)以及免疫印跡實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步的驗(yàn)證其靶基因;6.采用免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究靶基因和miR-125a在肝癌及癌旁組織中表達(dá)情況,并分析兩者的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)80例肝癌及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果表明,和癌旁相比,miR-125a在62例肝癌組織中低表達(dá),占總體樣本的77.5％,癌旁組織和癌組織的平均表達(dá)差異為4.

6、72倍。通過(guò)對(duì)臨床資料的分析,我們發(fā)現(xiàn)miR-125a在肝癌中的表達(dá)差異與肝癌患者較差的預(yù)后和發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　2.通過(guò)感染帶有miR-125a和對(duì)照microRNA的慢病毒,構(gòu)建成功能穩(wěn)定提高miR-125a表達(dá)的細(xì)胞系,MTT結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)miR-125a肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力在第四天開始受到抑制。其增殖能力明顯低于對(duì)照microRNA及親本細(xì)胞。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,與對(duì)照和親本細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)miR-125a的肝癌細(xì)胞得

7、到更少和更小的克隆。通過(guò)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-125a細(xì)胞組形成的腫瘤更小。
　　3.過(guò)表達(dá)miR125a能顯著抑制肝癌細(xì)胞體外的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。和體外實(shí)驗(yàn)相一致,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,注射表達(dá)對(duì)照micoRNA的肝癌細(xì)胞到裸鼠體內(nèi)形成了顯著的肝肺轉(zhuǎn)移灶,而注射miR-125a過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞的小鼠則只有較少的轉(zhuǎn)移灶形成。
　　4.通過(guò)MTT和Transwell實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)下調(diào)miR-125a會(huì)顯著提高肝癌細(xì)胞

8、的增殖和轉(zhuǎn)移能力。
　　5.通過(guò)雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng),我們發(fā)現(xiàn)miR-125a可以顯著降低含有MMP11和VEGF3‘UTR的報(bào)告基因載體的熒光素酶的活性。提示MMP11及VEGF可能為miR-125a的靶基因。qRT-PCR結(jié)果表明miR-125a可以顯著下調(diào)VEGF和MMP11的mRNA水平。Western blot在細(xì)胞蛋白水平證實(shí)了這一結(jié)果。
　　6.為了進(jìn)一步研究miR-125a和MMP11,VEGF在肝癌患者組

9、織中的表達(dá)情況,我們采用了免疫組化的方法檢測(cè)了MMP11和VEGF在此前用到的80對(duì)肝癌患者組織中的表達(dá)情況。通過(guò)spearman統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)miR-125a的表達(dá)和MMP11,VEGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1. miR-125a在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于配對(duì)的癌旁組織, miR-125a與肝癌的惡性表型顯著相關(guān);
　　2.過(guò)表達(dá)miR-125a能顯著抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖和轉(zhuǎn)移能力;
　　3.