肺癌與慢性阻塞性肺疾病的共同病因和遺傳易感性研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌與慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD）是呼吸系統(tǒng)最常見的兩種疾病，兩者關系極為密切。研究發(fā)現(xiàn)40-70％的肺癌患者伴發(fā)
　　COPD，而COPD患者的肺癌年發(fā)病率高達16.7/1000人年，遠超正常人群。我們前期開展的meta分析也顯示COPD患者發(fā)生肺癌的危險度是正常人的2.76倍。COPD可能是肺癌癌前病變的一種中間表型，其在吸煙所致

2、的癌變過程中存在中介效應。因此，對人群COPD的篩檢有助于肺癌的早期預防。對比分析國內外多個有關肺癌和COPD的流行病學研究，我們發(fā)現(xiàn)兩種疾病的環(huán)境病因和遺傳易感位點存在廣泛的重疊，這提示肺癌與COPD可能具有共同的發(fā)病機制，這些機制也可能是COPD患者肺癌高發(fā)的病理基礎。
　　肺癌和 COPD的發(fā)病機制十分復雜，基因和環(huán)境因素相互作用，共同影響了兩種疾病的進程。吸煙是兩者最主要的病因。我們通過比對有關肺癌、COPD及肺功能的全基

3、因組關聯(lián)研究（GWAS），結果發(fā)現(xiàn)三者的易感基因在人類染色體上有廣泛的重疊，如位于人類染色體15q24區(qū)上的尼古丁受體基因家族（CHRNA3-CHRNB4-CHRNA5）、過氧化物歧化酶3（Superoxide dismutase3，SOD3）、mutS同源物6（mutS homolog6，MSH6）和鈣粘著蛋白關聯(lián)蛋白（cadherin-associated protein alpha2，CTNNA2）等。在體內，上述基因主要參與胞外

4、信號識別和磷酸化信號傳導、氧化應激、DNA損傷修復和上皮細胞間質化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等過程。目前，研究已證實尼古丁受體和 EMT與肺癌和 COPD的發(fā)病，以及 COPD發(fā)展為肺癌的過程相關；而磷酸化信號傳導、氧化應激、DNA損傷與修復等胞內活動也都參與了肺癌和 COPD的發(fā)病過程。此外，上述途徑之間還存在相互串話（cross-talk）機制?；谏鲜鯣WAS的結果和有關肺癌與C

5、OPD病理機制的報道，我們推測，肺癌與 COPD可能存在共同的發(fā)病機制：環(huán)境因素作用于化學物受體，刺激細胞氧化應激反應，直接損傷基因組 DNA和誘發(fā) EMT；同時環(huán)境因素與受體結合后產生應激信號，經磷酸化信號通路級聯(lián)放大和轉移至核內，激活或抑制相關轉錄因子，調控氧化應激反應和EMT進程，共同促進肺癌和COPD的發(fā)生。
　　目前，對于肺癌與COPD的關系認識，多數是來源于肺癌的病例-對照研究或臨床特征描述；對肺癌和COPD可能具有的

6、共同環(huán)境病因和基因易感位點的認識，也都來自于各自獨立的疾病研究；肺癌的關聯(lián)研究中往往忽視了對COPD效應的分析。因此，本研究通過在廣州、蘇州兩中心，同時進行肺癌病例與對照、COPD病例與對照的平行研究，（1）揭示肺癌與COPD的共同環(huán)境危險因素，評價COPD在這些共同病因致肺癌發(fā)生中的中介效應；（2）沿著“受體→信號傳導途徑→轉錄調控因子→氧化應激、DNA損傷和EMT→肺部疾病”的研究思路，分析了尼古丁受體家族、氧化還原酶WWOX和EM

7、T調控基因的遺傳變異【包括單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）和拷貝數變異（copynumber variation，CNV）】與肺癌和COPD發(fā)病及預后的關聯(lián)，并探索陽性關聯(lián)位點的生物學功能，闡述肺癌與COPD的共同遺傳易感分子。以期從基因和環(huán)境以及基因-環(huán)境交互效應層面揭示肺癌與COPD的共同發(fā)病機制，從而為兩病的預防與控制提供新的思路和科學依據。
　　第一部分：肺癌與COPD的共

8、同病因及COPD中介效應分析
　　肺癌與COPD的關系極為密切。既往多個流行病學研究顯示兩者環(huán)境病因譜有廣泛的重疊，如吸煙、被動吸煙、職業(yè)暴露、肺部疾病史等。然而當前對肺癌和COPD環(huán)境病因的研究都是獨立開展的，地區(qū)、時間和種族間的異質性讓我們很難比較這些病因在肺癌和 COPD的效應差異，且目前仍未有研究系統(tǒng)化地闡述兩者的共同病因。另外，近期國外有研究發(fā)現(xiàn)COPD在吸煙導致的肺癌危險效應中起著中介作用。其他病因亦可能在致肺癌的過程

9、中起著類似效應，但尚未有研究報道。
　　目的：
　　揭示肺癌與COPD的共同環(huán)境病因譜及評價COPD在肺癌發(fā)病中的中介效應，分析肺癌和COPD的外在聯(lián)系，為兩病的綜合預防提供科學依據。
　　方法：
　　在廣州和蘇州兩地開展肺癌和COPD獨立的病例-對照研究。其中，肺癌的研究包括廣州地區(qū)肺癌病例1056例和正常健康對照1056例，蘇州地區(qū)肺癌503例和對照623例；COPD的研究包括廣州地區(qū)COPD病例1025例和

10、肺功能正常對照1061例，蘇州地區(qū)COPD病例486例和對照616例。對照皆按與病例性別相同、年齡（±5歲）以頻率配比的方法，從參加健康體檢項目的人群中進行隨機選擇。問卷收集個體特征和環(huán)境暴露等22個項目信息。采用SAS9.3軟件進行多因素logistic回歸模型分析，揭示肺癌和 COPD的共同環(huán)境暴露因素。利用無順序多變量 Logistic回歸模型和Sobel檢驗評價COPD在共同因素致肺癌發(fā)病過程中的中介效應。
　　結果：

11、r>　　肺結核史、肺氣腫史、吸煙（或吸煙量）、被動吸煙、職業(yè)接觸金屬毒物、住房通風差、使用生物燃料和少食蔬菜水果8項暴露因素能顯著增加肺癌和COPD的發(fā)病風險，其危險效應方向一致。進一步的無順序多變量Logistic回歸模型顯示，吸煙和使用生物燃料對COPD人群發(fā)生肺癌風險的增加效應（吸煙：OR=3.13；生物燃料：OR=2.99）顯著高于非COPD人群（吸煙：OR=1.31；生物燃料：OR=1.34）（P值分別為4.53×10-6和8

12、.42×10-5），且COPD在吸煙和生物燃料的致肺癌發(fā)病效應中具有顯著的中介作用，分別占據總效應的13.1%和6.1%（Sobel檢驗：P值分別為0.005和0.039）。
　　結論：
　　肺癌與 COPD的環(huán)境病因譜存在廣泛的重疊。COPD在吸煙和生物燃料的致肺癌效應中具有中介效應，提示吸煙者和生物燃料使用者傾向于先發(fā)生COPD再發(fā)展為肺癌，這為肺癌和COPD的人群預防提供了新的思路。
　　第二部分：肺癌與COPD

13、的共同遺傳易感性研究
　　第一節(jié)尼古丁受體3（CHRNA3）基因遺傳變異與肺癌和COPD發(fā)病及預后的關系
　　人類15號染色體長臂24區(qū)（15q24）是已明確的肺癌和COPD的易感基因區(qū)段，位于該區(qū)域內的尼古丁受體家族基因簇（CHRNA3-CHRNB4-CHRNA5）上的多個遺傳變異被報道與肺癌、COPD、肺功能和吸煙行為存在顯著關聯(lián)。我國人群的研究同樣報道了該區(qū)域還存在一個功能性的SNP rs6495309，其與肺癌發(fā)病和

14、吸煙行為密切相關，但我國人群尚未有研究進行上述基因變異與COPD發(fā)病關聯(lián)的探索。此外，吸煙可影響肺癌及 COPD的預后，這些 SNPs極有可能通過介導吸煙行為而影響肺癌或COPD的預后。因此，我們假設位于人類15q24區(qū)上的多態(tài)位點可能與我國人群肺癌和COPD的發(fā)病及預后相關。
　　目的：
　　分析人類15q24區(qū)上的SNPs在我國人群肺癌和COPD發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　利用連鎖不平衡分析（Lin

15、kage disequilibrium，LD）于GWAS報道的關聯(lián)SNPs中篩選出CHRNA3基因上兩個功能性的SNPs（rs6495309T>C和rs1051730G>A），通過PCR-RFLP的方法檢測前述人群的兩SNPs的基因型，用多因素logistic回歸模型和Log-Rank檢驗以及Cox回歸模型分別評估兩SNPs與疾病發(fā)病和預后關聯(lián)。針對陽性關聯(lián)位點rs6495309T>C，構建螢光素酶報告基因系統(tǒng)，分析T等位基因與C等位基

16、因的轉錄活性，并通過毒理學實驗，檢測兩等位基因對煙草凝集物、尼古丁、煙草亞硝胺（NNK）和苯并芘（BaP）刺激的敏感性差異。
　　結果：
　　rs6495309T>C與肺癌的關聯(lián)符合顯性遺傳模型，rs6495309C變異基因型（CC+TT）能顯著增加肺癌的發(fā)病風險（OR=1.57，95%CI=1.31-1.87），縮短肺癌患者的生存期，增加肺癌患者的死亡風險（HR=1.41，95%CI=1.13-1.75）；其與COPD的關

17、聯(lián)符合隱形遺傳模型，CC基因型能顯著增加 COPD的發(fā)病風險（OR=1.32，95%CI=1.14-1.54），加快肺功能下降，且與 COPD進展呈顯著正相關（P=0.033）。rs6495309T>C變異還與吸煙行為存在顯著的交互效應。體外實驗發(fā)現(xiàn)，相較T等位基因，攜帶C等位基因的啟動子轉錄活性更高，煙草凝集物和尼古丁刺激能顯著擴大兩等位基因之間的活性差異。而 rs1051730G>A與肺癌和 COPD的發(fā)病及預后的關聯(lián)皆沒有顯著性。

18、
　　結論：
　　CHRNA3基因SNP rs6495309C變異可顯著增加其基因的轉錄活性，提高機體細胞對毒物的敏感性，且與吸煙存在基因-環(huán)境交互效應，使得人群攜帶者對肺癌和COPD更為易感，病患攜帶者的肺癌和COPD預后更差。
　　第二節(jié)尼古丁受體7（CHRNA7）基因拷貝數變異與我國人群肺癌和COPD發(fā)病及預后的關聯(lián)研究
　　拷貝數變異（CNV）是基因組內廣泛存在的一種較大片段的遺傳變異，指的是1 kb以上

19、基因組大片段的拷貝數增加或者減少。相較單個位點核苷酸（SNP）的變化，CNV更易于引起基因的結構異常和表達水平的變化，從而影響疾病的發(fā)生與發(fā)展?？梢灶A見，位于疾病易感基因上的 CNVs極有可能影響人群疾病易感性。由此，我們假設位于尼古丁受體基因上的 CNVs可影響尼古丁基因功能而與我國人群肺癌和COPD發(fā)生、發(fā)展相關。
　　目的：
　　探索尼古丁受體家族基因拷貝數變異與肺癌和COPD的發(fā)病及預后的關系，闡明其生物學機制。

20、r>　　方法：
　　參考基因組變異數據庫（Database of Genomic Variants，DGV），從11個神經性尼古丁受體家族基因（CHRNA2、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA5、CHRNA6、CHRNA7、CHRNA9、CHRNA10、CHRNB2、CHRNB3和 CHRNB4）中選取中國人群拷貝數變異頻率>5%的拷貝數變異，分別為CHRNA7基因的CNV-3956和CHRNA10基因的CNV-3833。在前

21、期病例-對照研究的基礎上，利用中通量Accucopy法進行初步檢測，篩選潛在的陽性關聯(lián)位點，進而用Taqman實時定量技術進行大樣本的基因型鑒定。進一步在肺組織中檢測CHRNA7基因的表達水平，分析基因型-表型的關聯(lián)。
　　結果：
　　CHRNA7基因CNV-3956與肺癌的關聯(lián)符合隱性遺傳模型，攜帶4-copy基因型個體的肺癌發(fā)生風險是攜帶2、3-copy基因型個體的1.49倍（ OR=1.49，95%CI=1.29-1.

22、73）；且4-copy基因型肺癌患者肺癌生存期顯著短于后者（中位生存期：11月vs.14月；HR=1.25，95%CI=1.07-1.45）；CNV-3956與COPD的關聯(lián)符合顯性遺傳模型，相較2-copy基因型攜帶者，3/4-copy基因型攜帶者發(fā)生COPD的風險增加了45%（OR=1.45，95%CI=1.26-1.66），第一秒用力呼氣量（pre-Forced expiratory volume in one second，pr

23、e-FEV1）更低（P=1.46×10-5），且 FEV1值下降的更快（-0.113±0.156 vs.-0.078±0.099；t檢驗：P=0.034）。此外，CNV-3956與吸煙在增加肺癌和COPD發(fā)病風險上有顯著的交互作用。進一步分析CNV-3956拷貝數與吸煙量關系發(fā)現(xiàn)其與吸煙包年數成正相關（P=4.00×10-4）。
　　在肺癌組織中，CNV-3956拷貝數與CHRNA7基因mRNA和蛋白質水平呈顯著正相關（mRNA：

24、P=0.049；蛋白質：P=0.013）。本研究未發(fā)現(xiàn)CHRNA10基因CNV-3833與肺癌或COPD的發(fā)病或預后存在顯著關聯(lián)。
　　結論：
　　CHRNA7基因拷貝數變異CNV-3956可改變其基因表達，影響吸煙者吸煙量，從而改變肺癌和COPD發(fā)病的風險及預后，它可能是一個潛在的生物標志物，用于預測肺癌和COPD的發(fā)病風險和預后評價。
　　第三節(jié) EMT調控子Snai1基因外顯子Val118Ala變異能降低我國人群

25、肺癌和COPD的發(fā)病風險
　　上皮細胞間質性轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞轉分化為間質性細胞。近年來，大量研究提示EMT可促進肺癌和COPD的發(fā)生發(fā)展。GWAS亦報道了EMT相關基因的遺傳變異與肺癌和COPD的發(fā)病相關。在機體內，EMT主要由多個核內轉錄因子即EMT調控子所調控，這些分子發(fā)揮控制EMT過程的“開關”效應，可以下調上皮細胞標志物的表達，并上調間質細胞標志

26、物的表達。目前，已有多個EMT調控子被報道。其中，鋅指蛋白家族的Snai1和Slug，E盒結合鋅指蛋白Zeb1和Zeb2，以及基本螺旋環(huán)螺旋因子Twist1受到廣泛關注。因此，我們假設位于 EMT調控子基因上的潛在功能性多態(tài)可能通過單獨或聯(lián)合效應影響EMT的過程，最終導致肺癌或COPD易感。
　　目的：
　　探究與肺癌和COPD發(fā)生發(fā)展相關的EMT調控分子的潛在功能性SNPs，并探明其生物學機制。
　　方法：
　

27、　參考dbSNP數據庫，針對Snai1，Slug，Zeb1，Zeb2和Twist1這5個主要的EMT調控子，選取位于各編碼基因啟動子區(qū)（上游-2000bp）、5’-非翻譯區(qū)、外顯子區(qū)和3’-非翻譯區(qū)的常見（低發(fā)等位基因頻率>5%）潛在功能性多態(tài)位點，共7個SNPs，以Taqman基因分型技術檢測各SNP的基因型。針對所發(fā)現(xiàn)的陽性關聯(lián)位點，Snai1基因外顯子變異（Val118Ala），構建含不同等位基因的pcDNA3.1表達載體，轉染人

28、肺細胞系A549和16HBE，鏡下觀察細胞形態(tài)變化，利用劃痕實驗、Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力，采用熒光定量PCR和Western blot法檢測受Snai1轉錄調控的EMT標志分子E鈣粘著蛋白（E-cadherin，CDH1）、纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）和波形蛋白（Vimentin，VIM）的表達，分析攜帶不同118位氨基酸的Snai1蛋白的轉錄調控能力和促EMT效應差異。
　　結果：
　　V

29、al118Ala變異與肺癌和COPD的發(fā)病顯著相關，相較于118Ala純合基因型攜帶者，118Val雜合基因型和純合基因型攜帶者發(fā)生肺癌的風險下降24%（OR=0.76，95%CI=0.65-0.90），發(fā)生COPD的風險下降了22%（OR=0.78，95%CI=0.65-0.93）；118Val基因型降低肺癌風險的效應在COPD人群中更顯著（P=0.001）；Val118Ala還與肺癌吸煙患者的腫瘤分期相關（P=0.013），118A

30、la變異基因型能顯著降低吸煙患者腫瘤發(fā)生轉移的概率。體外功能實驗表明，過表達 Snai1-118Ala蛋白的細胞，其遷移和侵襲能力及間質化細胞特征皆弱于過表達Snai1-118Val的細胞；Snai1-118Ala上調間質細胞標志物FN和Vim的幅度顯著低于Snai1-118Val，但兩者對上皮標志物E-cad表達的調控無顯著性差異。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)其他EMT調控子的SNPs與肺癌或COPD的發(fā)病及預后有顯著關聯(lián)。
　　結論：<

31、br>　　EMT調控子Snai1基因外顯子Val118Ala的遺傳變異能影響該基因的轉錄調控能力，延緩肺上皮細胞的間質型轉化，從而降低肺癌和COPD的發(fā)病風險，其對肺癌的保護效應在COPD人群中更為顯著。
　　第四節(jié)氧化還原酶WWOX基因拷貝數變異影響我國人群肺癌和COPD的易感性
　　氧化應激（Oxidative Stress）是指體內氧化與抗氧化作用失衡，產生過氧化物和氧自由基，導致中性粒細胞炎性浸潤，損傷機體細胞成分如

32、DNA。氧化應激參與肺癌和 COPD的發(fā)生發(fā)展。近期一項在歐洲人群開展的 GWAS發(fā)現(xiàn)，位于編碼 WW結構域氧化還原酶（WWOX）基因上的遺傳變異（rs12716852）與肺功能有顯著關聯(lián)，而我們前期研究也發(fā)現(xiàn)該基因SNPs與我國人群的肺癌發(fā)病相關，提示該基因可能是肺癌和 COPD共有的易感基因。WWOX基因位于人類染色體普通脆性位點FRA16D（16q23~16q24.1）內，該區(qū)域存在大量的拷貝數變異（CNVs）。這些拷貝數變異極有

33、可能影響WWOX的基因結構或表達，從而與人群肺癌或COPD的易感性相關。因此，我們假設位于 WWOX基因上的 CNVs可影響我國人群的肺癌和COPD易感性。
　　目的：
　　研究氧化還原酶WWOX基因拷貝數變異與我國人群肺癌和COPD發(fā)病的關聯(lián)。
　　方法：
　　利用 Taqman實時定量技術檢測前述人群 WWOX基因常見的拷貝數變異CNV-67048，應用ACCUCOPY assay和Affymetrix Ge

34、nome-Wide HumanSNP Array6.0芯片驗證 Taqman技術結果檢測的準確性。對 WWOX進行轉錄子測序，分析CNV-67048與WWOX外顯子缺失的關系，并采取real-timePCR、western blot實驗檢測肺組織內WWOX基因的mRNA和蛋白表達水平，分析基因型-表型關聯(lián)，以揭示該遺傳變異的生物學功能。
　　結果：
　　CNV-67048拷貝數變異與肺癌發(fā)病風險呈顯著的劑量-效應關系（Ptr

35、end=1.12×10-10）。與野生2-copy基因型攜帶者比較，缺失基因型（1-拷貝或者0-拷貝）攜帶者發(fā)生肺癌的風險上升了40%（OR=1.40，95%CI=1.20-1.63）。CNV-67048基因型為缺失型的肺癌組織，其發(fā)生 WWOX外顯子6-8缺失的概率也顯著增加（P=0.021），其WWOX基因的表達水平也顯著低于2-copy基因型組織（P<0.05）。此外，該遺傳變異同樣與 COPD的發(fā)病相關，缺失基因型（1-拷貝或者

36、0-拷貝）攜帶者發(fā)生 COPD的風險是2-copy野生基因型攜帶者的1.30倍（ OR=1.30，95%CI=1.12-1.50）。
　　結論：
　　WWOX基因缺失型拷貝數變異CNV-67048與我國人群發(fā)生肺癌和COPD的易感性存在顯著關聯(lián)。其生物學機制可能是缺失型CNV-67048可增加WWOX發(fā)生外顯子6-8缺失的概率，導致WWOX表達低下或不表達，進而引起機體的氧化修復能力異常，從而促進肺癌和 COPD的共同發(fā)病。