HLA-E在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及預(yù)后意義.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌)在全世界每年新增人數(shù)約60萬(wàn)[1]，同時(shí)我國(guó)每年肝癌患者死亡人數(shù)超過(guò)40萬(wàn)[2]。手術(shù)切除是目前治療肝癌最有效的治療方式，縱然行根治性肝癌切除，其術(shù)后1年復(fù)發(fā)率高達(dá)40％[4]，且預(yù)后差，降低患者術(shù)后的生活質(zhì)量。目前肝癌的治療效果達(dá)不到人們的預(yù)期，基因靶向藥物的出現(xiàn)能提高了患者術(shù)后生存時(shí)間，改善患者生存質(zhì)量。人白細(xì)胞抗原E(Human leukocyt

2、e antigen-E(HLA-E))屬于非經(jīng)典主要組織相容性復(fù)合物(MHC-Ib)類分子，在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移，病毒感染，器官移植以及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。很多研究顯示HLA-E在許多腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)[1-3]，推測(cè)HLA-E能使腫瘤逃避免疫監(jiān)視，促使腫瘤增殖轉(zhuǎn)移。 目的：
　　本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)HLA-E在肝癌組織及其鄰近肝組織中的表達(dá)情況，分析HLA-E的表達(dá)情況與臨床病理資料及預(yù)

3、后之間的相關(guān)性;通過(guò)siRNA干擾HLA-E基因的表達(dá)，觀察對(duì)高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株MHCC97H增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響，將來(lái)為HLA-E可能作為肝癌等惡性腫瘤基因治療的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、通過(guò)免疫組化檢測(cè)84例肝癌組織及其鄰近肝組織的HLA-E表達(dá)情況，收集患者的臨床病理資料（包括:年齡，性別，腫瘤大小，門靜脈癌栓，TNM分期，腫瘤復(fù)發(fā)，手術(shù)日期，死亡時(shí)間，最后隨訪時(shí)間等）。統(tǒng)計(jì)分析HLA-E表達(dá)情況與臨床病

4、理資料及預(yù)后之間的相關(guān)性。
　　2、利用熒光標(biāo)記的siRNA摸索最佳轉(zhuǎn)染條件;將實(shí)驗(yàn)分成三組:HLA-E siRNA組，HLA-E siRNA陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX將體外設(shè)計(jì)合成的靶向抑制HLA-E的小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞株MHCC97H。運(yùn)用蛋白免疫印跡(Western Blot)及細(xì)胞免疫化學(xué)(ICC)檢測(cè)HLA-E總蛋白水平、細(xì)胞內(nèi)定位情況以及HLA-

5、E干擾后表達(dá)變化;應(yīng)用Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)HLA-E沉默后細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1、HLA-E在肝癌組織及鄰近肝組織中的表達(dá)
　　在肝癌組織及鄰近肝組織中的細(xì)胞膜和胞漿可見(jiàn)HLA-E表達(dá)，而細(xì)胞核未見(jiàn)染色。83.3％(70/84)的肝癌組織中HLA-E表達(dá)，而52.4％(44/84)的鄰近肝組織中HLA-E表達(dá)。肝癌組織的HLA-E染色得分高于鄰近肝組織(x2=18.448，P＜0.05)。<

6、br>　　2、HLA-E陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系
　　肝癌組織中HLA-E陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=5.145，P=0.023)，而與患者年齡(x2=0.995，P=0.329)、性別(x2=0.175，P=0.676)、門脈癌栓(x2=0.279，P=0.598)、腫瘤直徑(x2=2.154，P=0.142)、TNM分期(Z=1.182，P=0.237)等臨床病理資料之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、HLA-E與

7、肝癌預(yù)后的關(guān)系
　　Kaplan-Meier分析顯示HLA-E陽(yáng)性的肝癌患者生存時(shí)間明顯短于HLA-E陰性的肝癌患者(x2=6.448，P=0.011)。其中HLA-E陽(yáng)性患者術(shù)后平均生存時(shí)間為33.2個(gè)月(95％CI:28.0-38.4個(gè)月)，而HLA-E陰性的肝癌患者術(shù)后生存時(shí)間為52.3個(gè)月(95％CI:46.5-58.1個(gè)月)。腫瘤直徑≤5cm(45.5個(gè)月(95％CI:39.9-51.1個(gè)月)）的患者術(shù)后生存時(shí)間與腫瘤直

8、徑＞5cm(32.2個(gè)月(95％CI:25.1-39.3個(gè)月)）的患者(x2=5.622，P=0.018)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)COX回歸模型的單因素和多因素分析表明HLA-E陽(yáng)性表達(dá)、腫瘤直徑均是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。
　　4、評(píng)估轉(zhuǎn)染效率
　　評(píng)估在MHCC97H細(xì)胞株上siRNA轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX將攜帶紅色熒光的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，在熒光顯微鏡下，在胞漿內(nèi)可見(jiàn)

9、明顯的熒光，隨著siRNA濃度10至40nmol/L的增加，轉(zhuǎn)染效率呈劑量依賴性。綜合細(xì)胞毒性以及轉(zhuǎn)染效率等因素，應(yīng)用20nmol/L濃度siRNA，在MHCC97H肝癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染效率超過(guò)90％，紅色熒光可持續(xù)到轉(zhuǎn)染后96小時(shí)。經(jīng)優(yōu)化試驗(yàn)確定的最佳轉(zhuǎn)染條件為:傳代細(xì)胞數(shù)量2×105、siRNA轉(zhuǎn)染終濃度為20nmol/L。
　　5、檢測(cè)轉(zhuǎn)染HLA-E siRNA后蛋白表達(dá)水平
　　HLA-E轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株MHCC97H48

10、小時(shí)后，Western Blot結(jié)果顯示HLA-EsiRNA組中HLA-E總蛋白表達(dá)水平顯著低于HLA-E siRNA陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P＜0.05);細(xì)胞免疫化學(xué)(ICC)結(jié)果同樣也表明在HLA-E siRNA組中的HLA-E得分顯著低于HLA-E siRNA陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P＜0.05)，在胞漿內(nèi)HLA-E表達(dá)明顯減少。而HLA-E陰性對(duì)照組的HLA-E染色得分與空白對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。
　　

11、6、Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的侵襲能力
　　運(yùn)用Transwell侵襲試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)肝癌細(xì)胞株的侵襲能力的變化。Transwell侵襲試驗(yàn)表明HLA-E siRNA組侵襲至Transwell下室的細(xì)胞數(shù)顯著低于HLA-EsiRNA陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、HLA-E在肝癌組織中高表達(dá)，且HLA-E陽(yáng)性表達(dá)與肝癌復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，推測(cè)HLA-E在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，增