酶聯(lián)免疫法快速測定妊娠母馬血清中eCG含量的研究.pdf

1、本研究通過2個試驗制備了抗孕馬血清促性腺激素多克隆抗體(以下簡稱抗eCG多抗)并研究了eCG多抗免疫檢測試劑盒。試驗一通過選擇標準抗原、免疫兔子及對多抗進行提純及性質鑒定，制備出特異性較強的抗eCG多抗，從而為ELISA檢測提供條件。用辣根過氧化物酶標記制備的抗eCG多抗，并對直接競爭法和間接競爭法兩種檢測方法進行了初步比較，確定后者為試劑盒方法，從而為試劑盒制作奠定基礎；試驗二對選定的試劑盒檢測方法進行檢測條件的優(yōu)化，組裝出eCG多抗

2、免疫檢測試劑盒，并對其檢測結果進行評價。 試驗結果表明，美國Sigma公司產的eCG純度較高，制備的抗eCG多抗效價也較高，達10<'5>以上，蛋白含量為23.67 mg/ml，純化后效價接近4×10<'4>，蛋白含量為8.088 mg/ml，蛋白質回收率為47.85％。與促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)進行交義反應鑒定，發(fā)現(xiàn)其與LH有微弱交叉，而與FSH無交叉反應，考慮到LH在體內的含量及其微弱，故該多抗可用來做免疫檢測使

3、用。選擇了間接競爭法做為試劑盒的檢測方法。試劑盒檢測程序為：用標準抗原液(eCG+CBS(碳酸鹽緩沖液，0.05mol/l，pH 9.6))進行包被，包被條件為37℃孵育3h：PBST(PBS(磷酸鹽緩沖液)+吐溫20)洗滌后用0.5％的明膠進行封閉，封閉條件為37℃孵育2h；PBST洗滌后加入樣品液和一抗，樣品液為血清樣品+PBS(0.01mol/l，pH 7.4)，一抗為1000倍稀釋的抗eCG多抗，37℃孵育1.5h；；PBST洗

4、滌后加入二抗(羊抗兔)37℃孵育1h；PBST及雙蒸水洗滌后加入底物液，37℃避光反應10min，加入終止液(2M H<,2>SO<,4>)終止反應，在450 nm波長下，用酶標儀讀數(shù)。組裝的試劑盒檢測樣品效果良好，其檢測范圍為2.5-20 IU/ml，靈敏度為2.8 IU/ml，板內和板間變異系數(shù)分別為7.2％和14.2％。方法的線性關系良好(R<'2>=0.9828)。因此，本研究組裝的試劑盒可以用來檢測妊娠馬血清及eCG制劑。與常