核糖體蛋白R(shí)plB的乙?；约癕SMEG_4620的酶學(xué)特性研究.pdf

1、第一部分:核糖體蛋白R(shí)plB的乙?；揎椉捌鋵?duì)功能的影響
　　真核生物的乙酰化研究已經(jīng)非常廣泛和深入，而在原核生物中，雖然大量蛋白質(zhì)被報(bào)道有乙?；揎棧鼈儙缀鯀⑴c了生命活動(dòng)的所有過程，例如能量代謝、RNA轉(zhuǎn)錄、趨化性等，但是乙酰化對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響仍然知之甚少。本部分我們通過對(duì)乙?；D(zhuǎn)移酶Pat進(jìn)行兩步梯度純化并結(jié)合乙?；磻?yīng)發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白R(shí)plB可以被Pat乙酰化修飾，RplB蛋白不僅和復(fù)制起始蛋白DnaA、RNA聚合酶相互作

2、用，而且可以和rRNA結(jié)合，是蛋白質(zhì)翻譯中不可或缺的蛋白質(zhì)，因此為了進(jìn)一步考察在大腸埃希菌中乙?；瘜?duì)核糖體蛋白R(shí)plB功能的影響，本部分以E.coli K12菌株BW25113為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)以及生物化學(xué)等方法展開了如下幾部分的研究：
　　1.我們通過GST-pulldown的方法證明RplB和Pat、CobB存在相互作用，然后通過建立乙?；c去乙?；磻?yīng)體系，直接證明了RplB能被Pat乙酰化修飾以及被Cob

3、B去乙?；揎?；由于RplB和rRNA的結(jié)合與蛋白上所帶的正電荷密切相關(guān)，而乙酰化修飾則會(huì)中和賴氨酸所帶的正電荷，因此為了考察乙酰化對(duì)RplB功能的影響，我們體外將乙酰化修飾和未乙?；揎椀腞plB和rRNA進(jìn)行孵育之后跑瓊脂糖凝膠電泳觀察兩者與rRNA的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，RplB被乙?；揎椫螅crRNA的結(jié)合能力顯著下降。之后，我們對(duì)核糖體與非核糖體蛋白質(zhì)的賴氨酸含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)前者的含量明顯高于后者，提示了乙酰化有可能影響

4、到核糖體的組裝以及翻譯效率，而cobB敲除株的生長明顯低于野生株也暗示了這一點(diǎn)。
　　2.為了在體內(nèi)考察RplB受Pat/CobB乙?；{(diào)控，我們構(gòu)建了pSUMO-rplB質(zhì)粒并分別與pET28a-cobB以及pET28a-pat在BL21中共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與cobB共表達(dá)時(shí)RplB的乙?；陆?，而與pat共表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)其乙?；撸f明了Pat和CobB在體內(nèi)能對(duì)RplB進(jìn)行乙?；揎?；但是在BW25113與 pat、cobB敲除株中

5、表達(dá)RplB并比較其乙?；町悤r(shí)，發(fā)現(xiàn)cobB敲除株中RplB的乙酰化明顯高于野生株，而 pat敲除株RplB的乙酰化變化不明顯，說明了還存在其它對(duì)RplB進(jìn)行修飾的因子；最近報(bào)道稱AcP能作為乙?；w對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行乙酰化修飾，當(dāng)我們用AcP對(duì)RplB進(jìn)行處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)RplB的乙酰化有明顯的升高。
　　3.營養(yǎng)饑餓條件下細(xì)菌生長受阻，為了考察在此條件下RplB的乙?；欠駮?huì)發(fā)生變化，我們將對(duì)數(shù)期的菌轉(zhuǎn)入氮源缺失的PBS+0.5％

6、glucose中進(jìn)行饑餓處理，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，RplB的乙?；饾u增高。
　　綜上所述，核糖體蛋白R(shí)plB能被乙?；D(zhuǎn)移酶Pat和去乙?；窩obB共同調(diào)控，而且RplB的乙?；瘯?huì)降低其和rRNA的結(jié)合；另外我們發(fā)現(xiàn)RplB的乙?；诘答囸I條件下會(huì)逐漸增強(qiáng)，而且核糖體蛋白質(zhì)賴氨酸含量明顯高于非核糖體蛋白質(zhì)，這些都暗示了在氮源饑餓條件下，細(xì)菌可能通過調(diào)節(jié)RplB乃至整個(gè)核糖體的乙酰化來調(diào)控自身的生長。這些發(fā)現(xiàn)拓展了乙?；绊懙?/p>

7、白質(zhì)功能的研究，并為核糖體的研究開辟了新的天地。
　　第二部分:MSMEG_4620的去乙酰化和自身ADP-核糖基化修飾的研究
　　Sir2家族蛋白作為結(jié)構(gòu)和功能都非常保守的蛋白質(zhì)，參與了包括基因沉默、DNA損傷修復(fù)、生長代謝等幾乎所有的生命活動(dòng)；本部分我們通過NCBI Blast發(fā)現(xiàn)在恥垢分枝桿菌Mycobacterium smegmatis mc2155中除了存在SIRT2同源蛋白MSMEG_5175外，還存在一個(gè) SI

8、RT4同源蛋白MSMEG_4620，我們分析了體內(nèi)寄生和體外生長的分枝桿菌各個(gè)菌株中SIRT2和SIRT4同源蛋白的分布情況，發(fā)現(xiàn)前者只含有SIRT2同源蛋白，而后者則含有兩個(gè)同源蛋白，暗示SIRT4同源蛋白跟營養(yǎng)以及初級(jí)代謝密切相關(guān)，因此本課題采用分子生物學(xué)手段并結(jié)合微生物學(xué)以及生物化學(xué)等方法對(duì)MSMEG_4620作了進(jìn)一步的研究：
　　1.我們通過加長同源臂的方法構(gòu)建了MSMEG_4620敲除株，并比較了其和野生株在營養(yǎng)相對(duì)豐

9、富或者貧瘠的培養(yǎng)基中的生長差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)相對(duì)豐富的培養(yǎng)基中，兩者的生長沒什么差異，而在貧瘠的培養(yǎng)基中，MSMEG_4620敲除株明顯低于野生株，說明MSMEG_4620在體外生長的菌株mc2155中起著非常重要的作用。
　　2.為了考察MSMEG_4620的去乙酰化活性，我們通過以化學(xué)底物測(cè)熒光的方法和通過胞質(zhì)蛋白作Western blot檢測(cè)等方法發(fā)現(xiàn)MSMEG_4620在體外具有較弱的去乙酰化活性，但MSMEG_462

10、0敲除之后的胞質(zhì)蛋白乙?；黠@增強(qiáng)，暗示了體內(nèi)可能受到某些因子的激活，我們嘗試在體外反應(yīng)體系中加入各種脂肪酸，發(fā)現(xiàn)油酸可以對(duì)MSMEG_4620的去乙?；钚赃M(jìn)行激活。
　　3.為了考察MSMEG_4620的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，我們?cè)诜磻?yīng)中添加biotin-NAD+，并以avidin-HRP進(jìn)行Western blot考察ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性；以組蛋白作為底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)MSMEG_4620不能對(duì)組蛋白卻能對(duì)自身進(jìn)行

11、ADP-核糖基化修飾，而且這種修飾不能被ADP-ribose抑制，反應(yīng)體系通過HPLC也檢測(cè)不到ADP-ribose的產(chǎn)生。然后，我們對(duì)保守的氨基酸進(jìn)行了突變，發(fā)現(xiàn)ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性顯著下降，說明了這些氨基酸對(duì)其活性至關(guān)重要；接著通過化學(xué)處理的方法，發(fā)現(xiàn)NH2OH可以將MSMEG_4620的ADP-核糖修飾基團(tuán)去除，說明了修飾位點(diǎn)位于精氨酸上。另外，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在反應(yīng)體系當(dāng)中添加各種金屬離子，發(fā)現(xiàn)Fe3+可以增強(qiáng)MSMEG_4

12、620的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性。
　　4.我們比較了ADP-核糖修飾和未修飾的MSMEG_4620的去乙酰化活性，發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著差異，說明了MSMEG_4620的ADP-核糖修飾不影響其去乙?；钚浴５遣还苁悄姆N活性，MSMEG_4620都會(huì)消耗NAD+，因此我們比較了MSMEG_4620敲除株和野生株中的NAD+水平，發(fā)現(xiàn)前者總體而言高于后者。
　　綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)MSMEG_4620具有脂肪酸激活的去乙酰化活性