富勒烯新衍生物的合成、細(xì)胞毒性和放射細(xì)胞生物學(xué)活性研究.pdf

1、富勒烯(fullerene，C60)的出現(xiàn)為我們研究甲硝唑藥物載體打開了思路。本實(shí)驗(yàn)利用富勒烯母體的載帶活性，合成C60載帶CMNa體內(nèi)活性結(jié)構(gòu)甲硝唑(metronidazole)的全新化合物C60-甲硝唑藥物復(fù)合體，以期提高藥物在腫瘤部位的濃度，有效增加藥物與血管壁的接觸時(shí)間和接觸面積，有助于藥物穿過(guò)血管壁，增加藥物的血管外分布和藥物作用的靶向性；通過(guò)光照與射線的序貫作用，增加DNA鏈斷裂，提高該藥物復(fù)合體的腫瘤細(xì)胞殺傷力，減輕放療副

2、作用。 另外，富勒烯母體本身的生物學(xué)效應(yīng)研究遇到不少障礙，其中最大的障礙是它難溶于水，因此仍有許多基本問(wèn)題尚未解決，如母體的細(xì)胞毒性。有學(xué)者通過(guò)接入不同衍生基團(tuán)提高水溶性，但富勒烯衍生物的行為并不能代表富勒烯本身，功能基團(tuán)的加入和極性的改變會(huì)使得富勒烯衍生物的生物行為與富勒烯本身相比可能會(huì)有不同的特點(diǎn)；且衍生物一旦進(jìn)入體內(nèi)參與各種化學(xué)反應(yīng)和生物代謝時(shí)，將去除支鏈而轉(zhuǎn)變?yōu)槟阁w，這使得C60母體的生物學(xué)行為研究顯得更加重要，其生物學(xué)

3、特性可對(duì)衍生物的行為研究起到預(yù)測(cè)、指導(dǎo)作用。為此本實(shí)驗(yàn)借助助溶劑將C60溶于水中形成C60-H2O溶膠混懸液，在細(xì)胞水平檢測(cè)驗(yàn)證富勒烯母體對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，探討其細(xì)胞毒性及相關(guān)機(jī)理；同時(shí)檢測(cè)富勒烯和富勒烯-甲硝唑衍生物的輻射細(xì)胞生物學(xué)活性，為開展該類化合物在放射生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要研究結(jié)果和討論如下： 1、富勒烯-甲硝唑(C60-Metronidazole)藥物復(fù)合體的合成 具有放射增敏作用的甲硝唑在

4、體內(nèi)的活性基團(tuán)為醇羥基和芳香硝基，為此我們嘗試以C60為載體，通過(guò)將醇羥基與酸成酯，或?qū)⒋剂u基先鹵化再胺化，與酸縮和成酰胺，抑或?qū)⑾趸€原成氨基后與酸縮和成酰胺，再與富勒烯母體相連形成藥物載體。但經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們依照原設(shè)計(jì)路線合成富勒烯-甲硝唑衍生物時(shí)，反應(yīng)并未得到所設(shè)想的攜載單個(gè)甲硝唑分子的化合物，而是中間體化合物NC2和NC3(見Fig.1.B，C)。通過(guò)甲硝唑先與丙二酸成酯，再與Fullerene[C60]發(fā)生[1+2]環(huán)加成反

5、應(yīng)，從而將甲硝唑連接到Fullerene[C60]上，形成目標(biāo)化合物C60-metronidazole復(fù)合體NC4(見Fig.1.D)，并通過(guò)紅外光譜(infraredspectroscopy，IR)、核磁共振氫譜(1Hnuclearmagneticresonance，1H-NMR)結(jié)構(gòu)確認(rèn)。NC5(見Fig.1.E)為反應(yīng)的副產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)和活性有待進(jìn)一步檢測(cè)。 Fig.1富勒烯及其新衍生物2、富勒烯母體水溶膠(Nano-C60

6、)的制備及其不同衍生物的細(xì)胞毒性研究 由于很難溶于水，對(duì)富勒烯母體的生物學(xué)活性研究不多。本課題通過(guò)助溶劑四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)將富勒烯母體結(jié)合到水中形成一定濃度的C60水溶膠NC1(見Fig.1.A)，透射電子顯微鏡下觀察顆粒直徑約為10～100nm。所制備的富勒烯母體水溶膠又稱為Nano-C60，用于本課題關(guān)于富勒烯母體的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。 本研究采用的兩株細(xì)胞為B16和SMMC-7721。MT

7、T法顯示，在較高濃度范圍內(nèi)(72μg/L～7200μg/L)，Nano-C60作用B16、SMMC-7721兩株細(xì)胞后，細(xì)胞增殖均受到明顯抑制，且隨濃度的增加抑制效應(yīng)增強(qiáng)，但低濃度在一定的時(shí)間段內(nèi)并無(wú)細(xì)胞毒作用；NC1的細(xì)胞毒性與化合物作用的時(shí)間和劑量相關(guān)，且不同細(xì)胞株對(duì)Nano-C60的毒性反應(yīng)在相應(yīng)的時(shí)間和劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的差異，細(xì)胞存活率下降至同一水平，較之B16，SMMC-7721需要相同濃度的NC1作用更長(zhǎng)時(shí)間。NC1的細(xì)

8、胞毒性與光作用有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，富勒烯母體在體外實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的毒性可能與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。結(jié)合普通光鏡和熒光顯微鏡Hoechst33258細(xì)胞染色觀察，從形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)不同濃度的Nano-C60作用不同時(shí)間后能出現(xiàn)較明顯的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，但作用靶部位有所不同；通過(guò)AnnexinV/PI雙染檢測(cè)，NC1低濃度長(zhǎng)時(shí)間作用的細(xì)胞改變以右下象限的早期凋亡為主，而較高濃度作用時(shí)間較短的細(xì)胞則突出表現(xiàn)為細(xì)胞膜損傷，即集中于右上象限晚期凋亡細(xì)胞為

9、主，各組有明顯差別(p＜0.01)。 另外，通過(guò)MTT法檢測(cè)富勒烯不同基團(tuán)衍生物的細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)，其毒性大小與側(cè)鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)。隨著富勒烯構(gòu)架上衍生化基團(tuán)的增多，細(xì)胞毒性趨于減輕。其中富勒烯母體NC1對(duì)SMMC-7721細(xì)胞毒性最強(qiáng)。 通過(guò)激光共聚焦及分光光度檢測(cè)，與對(duì)照組相比，B16細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)Nano-C60作用后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)增多，這可能是誘導(dǎo)細(xì)

10、胞發(fā)生凋亡引發(fā)細(xì)胞毒性的主要因素。另外細(xì)胞膜氧化損傷指標(biāo)SOD(superoxidedismutase，超氧化物歧化酶)和MDA(malondialdehyde，丙二醛)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在NC172μg/L作用細(xì)胞2～36小時(shí)SOD活力改變經(jīng)歷了緩慢上升的過(guò)程，但到了48小時(shí)，SOD的活性明顯下降，這可能與細(xì)胞的應(yīng)急抗氧化機(jī)制有關(guān)；MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化(lipidperoxidation，LPO)的程度，B16細(xì)胞和SMMC-77

11、21細(xì)胞受較高濃度NC1作用后MDA也逐漸增高，可能與NC1誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS有關(guān)。各種活性氧自由基會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生包括膜損傷、凋亡等在內(nèi)的各種損傷。 3、富勒烯及其衍生物的放射生物效應(yīng)研究 富勒烯在發(fā)現(xiàn)之初，就表現(xiàn)出良好的光敏活性，但富勒烯母體及其衍生物是否在電離輻射作用下也表現(xiàn)出相似的活性尚是空白，為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行C60水溶膠(NC1)以及新合成的C60-Metronidazole(NC4)的光毒性檢測(cè)，并結(jié)合γ射

12、線的作用觀察該類化合物的放射生物細(xì)胞學(xué)活性，比較NC1、NC4及其與藥物前體甲硝唑的細(xì)胞放射效應(yīng)之間的差異。 首先比較了NC1和NC4的光毒性，形態(tài)學(xué)觀察和AnnexinV/PI染色表明，在光的激發(fā)下，相應(yīng)濃度NC1和NC4促進(jìn)細(xì)胞膜的損傷。由于側(cè)鏈的加入，NC4在光作用下的細(xì)胞抑制率低于母體NC1。再結(jié)合Y線照射，通過(guò)細(xì)胞克隆法和MTT發(fā)現(xiàn)，NC1和NC4光照與Y線照射效應(yīng)之間存在著協(xié)同增強(qiáng)作用，相對(duì)于對(duì)照組，不同照射的序貫作

13、用能使細(xì)胞活存曲線下移；經(jīng)過(guò)光照后再接受2GyY線照射的B16細(xì)胞的存活率，明顯低于單獨(dú)4GyY線照射的細(xì)胞存活率；且該作用與Y線照射時(shí)是否有化合物同存有關(guān)，保持一定濃度NC1作用即接受Y線照射的B16細(xì)胞，在照射劑量達(dá)8Gy以后表現(xiàn)出存活率下降趨緩；但NC4并無(wú)類似表現(xiàn)；光照、Y線照射之間的間隔時(shí)間越短，效應(yīng)越明顯；此外與母體藥物metronidazole相比，一定照射劑量下，NC4作用的細(xì)胞受照后活存率下降更低，提示該藥物復(fù)合體的活

14、性較為理想，可能與藥物復(fù)合體中的富勒烯成份使metronidazole聚集有關(guān)；激光共聚焦顯微鏡下用DCFH-DA探針(2,7-dichlorofluoresceindiacetate2'，7'-雙乙酸鹽二氯熒光素)檢測(cè)ROS的含量變化，NC1和NC4在光和Y輻射下的活性與B16細(xì)胞內(nèi)生成更多的ROS有關(guān)；CometAssay檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NC1和NC4能促進(jìn)Y線照射后引起的DNA損傷并抑制其修復(fù)，NC4比NC1的抑制作用更強(qiáng)；連同化合物一

15、起照射的B16細(xì)胞，由于滯留細(xì)胞內(nèi)的化合物結(jié)構(gòu)上可能與抑制DNA損傷修復(fù)的某些酶的活性部位相似，通過(guò)影響潛在性致死損傷和亞致死損傷的修復(fù)而增加DNA損傷。 總之，本實(shí)驗(yàn)合成了富勒烯全新衍生物富勒烯-甲硝唑復(fù)合體并制備了富勒烯母體水溶膠，初步從細(xì)胞水平檢測(cè)其光毒性，同時(shí)結(jié)合Y電離輻射和不同光照條件，觀察其潛在的光敏/放敏活性，豐富了富勒烯及其衍生物的生物活性內(nèi)容，為更好地將富勒烯用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。水溶性富勒烯及其