出血性大腸桿菌(EHEC)O157-H7效應(yīng)蛋白NleL和宿主蛋白ZBED1相互作用的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證.pdf

1、出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7是一種食源性和水源性的病原菌,該菌通過(guò)III型分泌系統(tǒng)將效應(yīng)蛋白注入至宿主細(xì)胞中產(chǎn)生粘附與脫落(A/E)損傷而致病,它的感染會(huì)導(dǎo)致出血性腸炎并極有可能出現(xiàn)致命的出血性尿毒綜合癥,是一種全球范圍內(nèi)高度關(guān)注的病原菌。NleL(non-lee-encoded-effector-Ligase)是由Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的一種具有真核細(xì)胞泛素化E3連接酶活性的效應(yīng)蛋白,然而它在宿主細(xì)胞內(nèi)的底物和作用機(jī)制尚不清楚。

2、
　　本文通過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)重組子的構(gòu)建、蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)與純化、蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位、酵母雙雜交、GST pull-down和體外泛素化等實(shí)驗(yàn)方法來(lái)篩選和驗(yàn)證效應(yīng)蛋白NleL在真核細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白,取得了以下結(jié)果:
　　1.酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選NleL可能作用于宿主的底物蛋白ZBED1
　　酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)初次篩選出可能與效應(yīng)蛋白NleL相互作用的真核宿主細(xì)胞蛋白ZBED1,在SD-2和SD-4板均能生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆,經(jīng)擴(kuò)增、

3、雙酶切、測(cè)序分析比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)的確是ZBED1序列,可初步推斷宿主蛋白ZBED1與效應(yīng)蛋白NleL之間有可能存在相互作用。
　　2. NleL(GST-NleL)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
　　本研究成功純化了帶有 GST和 His雙標(biāo)簽的 NleL的全長(zhǎng)蛋白GST-NleL-His和其帶單標(biāo)簽的片段 GST-NleL170-782-WT蛋白。結(jié)果表明,在純化方法上用GST-beads純化方法優(yōu)于用Ni-NTA方法;純化獲得的Nle

4、L融合蛋白的純度和質(zhì)量也滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求,融合蛋白可以冷凍儲(chǔ)存為后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)備用。
　　3.效應(yīng)蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1結(jié)合試驗(yàn)
　　用GST pulldown試驗(yàn)驗(yàn)證了宿主蛋白ZBED1與效應(yīng)蛋白NleL的相互結(jié)合, western blot檢測(cè)顯示蛋白 GST-NleL-His與 NleL蛋白的片段GST-NleL170-782WT都與宿主蛋白ZBED1在體外產(chǎn)生較強(qiáng)的相互結(jié)合,由ZBED1與GST-NleL

5、170-782WT的相互結(jié)合可以推測(cè):效應(yīng)蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1相互結(jié)合的位點(diǎn)有可能位于第170-782氨基殘基之間。
　　4.效應(yīng)蛋白NleL與宿主蛋白ZBED1的體外泛素化試驗(yàn)
　　已有研究顯示NleL具E3連接酶活性,且其泛素化的活性與第753位的半胱氨酸殘基有關(guān),本研究通過(guò)NleL與ZBED1體外泛素化實(shí)驗(yàn)探究了NleL是否通過(guò)該活性作用于底物ZBED1。結(jié)果表明,宿主蛋白ZBED1存在自泛素化現(xiàn)象,Nle

6、L全長(zhǎng)蛋白融合蛋白GST-NleL-His、NleL的第753位點(diǎn)突變片段融合蛋白GST-NleL170-782C753A與底物ZBED1蛋白相互作用后,ZBED1的自泛素化作用明顯減弱,效應(yīng)蛋白 NleL可能是通過(guò)影響宿主蛋白 ZBED1的自泛素化作用而影響宿主細(xì)胞的生理活動(dòng);NleL的第753位點(diǎn)突變片段融合蛋白GST-NleL170-782C753A與未突變的全長(zhǎng)蛋白作用效果相同,表明NleL蛋白不是通過(guò)E3連接酶的活性來(lái)影響ZB

7、ED1的生理作用的。
　　5.效應(yīng)蛋白NleL在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與定位
　　明確效應(yīng)蛋白NleL在細(xì)胞內(nèi)的定位對(duì)于探究其在真核細(xì)胞中的作用機(jī)制是十分必要的。本研究成功構(gòu)建出能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)帶EGFP的NleL融合蛋白重組質(zhì)粒 pCDNA3.0-UTR-EGFP-NleL-HA,將該質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pCDNA3.0-UTR-EGFP-HA轉(zhuǎn)染293T和Hela細(xì)胞后,觀察顯示NleL蛋白絕大多數(shù)定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),亦有少量進(jìn)入到

8、細(xì)胞核中;對(duì)照組EGFP熒光蛋白在整個(gè)細(xì)胞中均有分布,沒(méi)有明顯的細(xì)胞定位特異性。由此可推測(cè),NleL效應(yīng)蛋白進(jìn)入真核細(xì)胞后,可能在細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞核中與不同的底物蛋白發(fā)揮不同的作用。
　　總之,本研究通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)首次成功篩選到效應(yīng)蛋白NleL在宿主細(xì)胞中的潛在底物ZBED1,并且通過(guò)GST pull-down試驗(yàn)和與體外泛素化試驗(yàn)初步探討了 NleL蛋白的相互作用,并明確了 NleL蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的定位,為今后進(jìn)一步探究該蛋