以脫礦脫細(xì)胞骨基質(zhì)環(huán)為支架構(gòu)建組織工程化椎間盤(pán)纖維環(huán)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、下腰痛是現(xiàn)代社會(huì)中一種常見(jiàn)病和多發(fā)病，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)不但在老年發(fā)病率高，而且在青壯年中發(fā)病率也非常高，成為導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要原因之一。下腰痛最主要的原因是椎間盤(pán)疾病，其中腰椎間盤(pán)突出癥等椎間盤(pán)退變性疾病(diScdegeneration disease，DDD)是最常見(jiàn)的椎間盤(pán)疾病。隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的發(fā)展，DDD越來(lái)越成為嚴(yán)重影響人民生活和生產(chǎn)的疾病。 目前治療DDD的方法主要有藥物、封閉、理療和手術(shù)，其中手術(shù)治療是最有效

2、和最普遍的治療方法。即使是近幾年開(kāi)展的椎間盤(pán)微創(chuàng)手術(shù)仍然破壞了椎間盤(pán)的結(jié)構(gòu)。手術(shù)的后果是椎間隙變窄，脊柱生物力學(xué)功能紊亂、退變加速，最終導(dǎo)致不穩(wěn)需要融合手術(shù)穩(wěn)定節(jié)段。融合手術(shù)的代價(jià)是運(yùn)動(dòng)功能的喪失，這種治療方法與功能重建的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展方向背道而馳。人工椎間盤(pán)假體的遠(yuǎn)期效果難以令人滿(mǎn)意。同種異體椎間盤(pán)移植術(shù)存在免疫排斥反應(yīng)和傳播疾病的可能，更重要的缺點(diǎn)是來(lái)源有限和倫理f可題。理論上使用組織工程學(xué)技術(shù)對(duì)椎間盤(pán)的生物學(xué)修復(fù)是最為理想的治療方法

3、。因此，研究并開(kāi)發(fā)組織工程椎間盤(pán)，對(duì)椎間盤(pán)進(jìn)行生物學(xué)修復(fù)和功能重建，已成為治療退行性椎間盤(pán)疾病理想的解決方案。 椎間盤(pán)包括纖維環(huán)和內(nèi)部的凝膠樣核心．髓核兩個(gè)部分。理論上，纖維環(huán)的再生修復(fù)是椎間盤(pán)組織工程首先要研究的問(wèn)題，因?yàn)槠茡p的纖維環(huán)沒(méi)有自身修復(fù)和再生的能力，缺少纖維環(huán)的包容，沒(méi)有任何方法能夠讓髓核組織填充并保持在椎間隙。只有纖維環(huán)完整結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)的條件下，不同程度的DDD才能進(jìn)一步治療：對(duì)于椎間盤(pán)病變的早期，如果只有纖維環(huán)破

4、裂而沒(méi)有髓核突出，可以使用組織工程化技術(shù)來(lái)修復(fù)纖維環(huán)，對(duì)髓核的病變可采用刺激逆轉(zhuǎn)退變的治療，比如各種生長(zhǎng)因子的注射、基因修飾細(xì)胞注射等；對(duì)于病變的晚期，髓核已經(jīng)突出或脫出需要摘除髓核，就需要組織工程化纖維環(huán)和組織工程化髓核共同移植才能達(dá)到治療目的。 脫礦骨基質(zhì)明膠作為支架材料應(yīng)用在軟骨組織工程，在體外成功構(gòu)建了軟骨組織塊，證實(shí)了脫礦骨基質(zhì)明膠具有同種異體骨來(lái)源廣泛、降解過(guò)程不會(huì)出現(xiàn)其他支架材料的毒性、可以冷凍后長(zhǎng)期保持生物學(xué)和生

5、物力學(xué)性能等特點(diǎn)，肯定了其良好的性能。脫細(xì)胞天然組織作為組織工程支架材料在肌腱、血管等的組織工程研究中已經(jīng)成功廣泛應(yīng)用。能否使用脫礦、脫細(xì)胞骨基質(zhì)作為支架材料用于組織工程化纖維環(huán)的構(gòu)建研究?此支架有何材料和生物力學(xué)特點(diǎn)?種子細(xì)胞能否粘附支架內(nèi)部并增殖和行使功能?鑒于文獻(xiàn)中沒(méi)有此方面的報(bào)道，為了回答以上問(wèn)題，本研究使用組織工程學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)，從制備兔脫礦、脫細(xì)胞骨基質(zhì)環(huán)入手展開(kāi)研究。首先，獲得了具有合適理化性能以及低免疫源

6、性的纖維環(huán)支架材料。其次，分離培養(yǎng)了兔椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞，在體外進(jìn)行單層培養(yǎng)和擴(kuò)增，得到了表型穩(wěn)定、增殖活力強(qiáng)、數(shù)量充足的種子細(xì)胞。再次，分別使用靜態(tài)沉淀法和纖維蛋白凝膠接種技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞支架復(fù)合體，證實(shí)了兩種方法均能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞粘附和擴(kuò)增，但后者細(xì)胞黏附數(shù)量更多、分布更均勻、增殖更快。最后，將構(gòu)建的細(xì)胞支架復(fù)合體分別進(jìn)行體外靜態(tài)培養(yǎng)和裸鼠皮下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)鑒定證實(shí)培養(yǎng)產(chǎn)物為類(lèi)纖維環(huán)組織，更深入地證實(shí)了種子細(xì)胞在支架內(nèi)增殖并能夠行使生物學(xué)功能，其中

7、裸鼠皮下培養(yǎng)產(chǎn)物更接近纖維環(huán)組織。 研究取得的主要結(jié)論總結(jié)如下： 1．經(jīng)過(guò)脫礦脫細(xì)胞塑形等處理獲得了與纖維環(huán)外形一致的具有多孔結(jié)構(gòu)的支架材料，外周較為致密，有一定的力學(xué)強(qiáng)度，內(nèi)層疏松便于種子細(xì)胞種植，環(huán)行結(jié)構(gòu)內(nèi)部空隙為以后組織工程髓核提供空間。其在平均孔徑、孔隙度、吸水力等指標(biāo)上達(dá)到了支架材料的要求。具有一定的彈性和未明顯下降的降解性。材料的免疫源性比較低，未產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫炎癥反應(yīng)。初步達(dá)到了支架材料的基本要求，為進(jìn)一步

8、深入進(jìn)行組織工程纖維環(huán)的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2．從兔取椎間盤(pán)纖維環(huán)組織，使用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶兩步酶消化法分離取得纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行接種培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖較慢。傳代培養(yǎng)的第一代細(xì)胞，形態(tài)與原代相似，細(xì)胞活力未顯著下降，具有纖維環(huán)細(xì)胞的表型特點(diǎn)。第一代細(xì)胞增殖匯合速度較原代細(xì)胞明顯加快，可以快速擴(kuò)增大量細(xì)胞用于組織工程化纖維環(huán)的研究。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究提供了表型穩(wěn)定和數(shù)量充足的種子細(xì)胞。 3．使用培養(yǎng)的第一代纖維環(huán)細(xì)胞

9、作為種子細(xì)胞以及脫礦、脫細(xì)胞骨基質(zhì)環(huán)為支架材料，分別使用靜態(tài)接種技術(shù)和纖維蛋白凝膠種植技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞支架復(fù)合體，均可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞黏附于支架并在支架內(nèi)增殖。采用纖維蛋白凝膠種植技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞支架復(fù)合體較靜態(tài)接種技術(shù)可以使細(xì)胞黏附數(shù)量更大，分布更加均勻，并且細(xì)胞增殖更快。本實(shí)驗(yàn)為更好地進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)創(chuàng)造了更為有利的條件。 4．采用纖維蛋白凝膠種植技術(shù)構(gòu)建的細(xì)胞支架復(fù)合體，使用體外靜態(tài)培養(yǎng)方法得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)檢測(cè)證實(shí)培養(yǎng)產(chǎn)物組織內(nèi)的細(xì)胞能夠保